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人皮下、网膜脂肪组织来源前脂肪细胞的原代培养及甘精胰岛素对其增殖、分化的影响
目的 探讨人皮下、网膜脂肪组织来源的前脂肪细胞形态、功能的差异,观察不同浓度甘精胰岛素对其增殖、分化的影响.方法 胶原酶分离法原代培养人皮下、网膜前脂肪细胞,倒置显微镜下观察不同来源的人前脂肪细胞在形态方面的差异,不同浓度甘精胰岛素(20、200、500、1000、1500 nmol/L)干预其增殖及分化过程,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测二者增殖的差异,实时定量PCR检测脂肪分化相关基因表达的差异.结果 (1)可从人皮下、网膜脂肪组织分离出前脂肪细胞,并在体外扩增,皮下前脂肪细胞更细长,容易增殖,而网膜前脂肪细胞呈多角形,易于老化.(2) MTT法结果显示甘精胰岛素抑制网膜前脂肪细胞的体外增殖,且其抑制作用具有剂量依赖性,1000 nmol/L干预72 h后,与未加胰岛素组相比,网膜前脂肪细胞的增殖明显低[吸光度(A)值:0.144±0.021比0.267±0.040,P＜0.01]；皮下前脂肪细胞作用不明显(A值:0.305±0.045比0.350±0.037,P＞0.05).(3)500 nmol/L的胰岛素浓度是人前脂肪细胞分化的适宜浓度,PCR结果显示该浓度时,对于皮下前脂肪细胞,脂肪分化的标志基因过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR)γ(F=31.31,P＜0.01)和CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)mRNA表达高(F =9.86,P＜0.05),前脂肪细胞的标志基因Pref-1表达低(皮下F=68.95,P＜0.01;网膜F=30.38,P ＜0.01),但是胰岛素浓度对网膜脂肪细胞PPARγ、C/EBPα mRNA影响不大(均P＞0.05).结论 甘精胰岛素可抑制人网膜前脂肪细胞的增殖,促进皮下、网膜前脂肪细胞的分化.
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人甲状腺成体干细胞的分离、培养及诱导分化
目的 探索甲状腺成体干细胞的分离和培养方法.方法 应用流式细胞荧光激活分选法从甲状腺结节组织中分离出侧群干细胞,从干细胞标志物表达及细胞形态特征等方面进行鉴定；同时应用悬浮培养方式促进干细胞的迅速增殖,进一步应用促甲状腺素(TSH)对甲状腺干细胞进行诱导分化,后检测其基因谱及摄碘能力的变化.结果 侧群细胞显示出典型的干细胞表达谱及细胞形态特征；同时在干细胞生长因子的刺激下甲状腺干细胞可以悬浮细胞球的方式迅速增殖,亦表达干细胞表面分子ATP-结合盒转运载体蛋白2(ABCG2)及甲状腺干细胞核因子.在TSH的作用下干细胞球来源细胞可逐渐分化为表达甲状腺分化标志物的甲状腺滤泡样细胞,并形成具有较强摄碘能力的滤泡样结构.结论 存在于甲状腺结节组织中的干细胞能在干细胞生长因子的刺激下以细胞球的方式迅速扩增,并在TSH的诱导下向甲状腺滤泡样细胞分化.
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采用视频系统的细胞原位计数法
在体外细胞培养过程中,细胞生长曲线是反映细胞生物学特性十分重要的指标.传统细胞生长曲线的绘制方法,是通过胰酶消化后制成细胞悬液,显微镜下计数,然后计算出细胞总数[1].这种方法不能在不同时相或用药前后进行自身对照观察,因此我们在实验中采用定位微量细胞培养技术及细胞原位计数法[2],并将视频系统引入该方法中,现简介如下.1 仪器及设备选用菲利浦VR-HD 1000录像机、松下TC-2140监视器、奥林巴斯IX 70倒置显微镜、细胞培养容器(丹麦NUNC 6孔板、12孔板或培养皿)、小玻璃管(外径为6 mm,长为3.5 cm,一端为盲端)、血盖片或普通盖片、投影胶片(非复印型)等.
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卵泡刺激素及戊酸雌二醇对小鼠卵母细胞体外成熟的影响
目的:探讨卵泡刺激素(FSH)、戊酸雌二醇(E2)对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟、受精及卵裂能力的影响.方法:对雌性小鼠进行超促排卵后处死小鼠,取出卵巢,刺破卵泡,收集形态较好的未成熟卵母细胞,随机分为6组,在不添加激素的基础培养液中以及分别添加10,50 IU/mL的FSH及1,10,100 mg/L的戊酸E2的培养液中培养24h后,观察各组卵母细胞的成熟情况.对已成熟的卵母细胞进行体外受精,观察卵母细胞受精情况.受精后继续培养48～72 h,观察其卵裂情况.比较各组的成熟率、受精率和卵裂率.结果:①各浓度FSH组及各浓度戊酸E2组与对照组相比,成熟率[生发卵泡破裂率(GVBD率)、MⅡ率]及卵裂率的差别均无统计学意义(P＞0.05).②10,50 IU/mL FSH组以及10 mg/L戊酸E2组的受精率分别为41.18％,40％和42.86％,均高于对照组(19.44％),差异有统计学意义(P＜0.05);1,100 mg/L戊酸E2组与对照组相比受精率差异均无统计学意义(P＞0.05).③各浓度FSH组之间以及各浓度戊酸E2组之间成熟率(GVBD率、MⅡ率)、受精率及卵裂率的差别均无统计学意义(P＞0.05).结论:在小鼠体外成熟培养液中添加10,50 IU/mLFSH及10 mg/L戊酸E2能促进小鼠卵母细胞胞质的成熟,从而提高受精率.
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人羊膜上皮细胞的分离培养及其免疫原性初步研究
目的:分离培养人羊膜上皮细胞(HAEC),通过与同种异体淋巴细胞混合培养探讨HAEC的免疫原性,为进一步的临床研究提供指导.方法:体外分离培养HAEC,透射电镜观察细胞超微结构,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和细胞免疫荧光方法检测上皮细胞相关基因及细胞表面标记细胞角蛋白CK18表达情况.与同种异体外周血来源淋巴细胞建立混合淋巴细胞(the mixed lymphocyte reaction,MLR)反应体系,通过MTT去检测细胞增殖率.结果:分离得到的HAEC具有上皮细胞特异性的微绒毛结构,表达上皮细胞相关基因CDHl,claudin 3和claudin4,并表现为细胞角蛋白CK18阳性.MTT分析检测OD值结果显示,在HAEC细胞与淋巴细胞浓度分别为1∶2000,1∶200和1∶20时各组的OD值分别为0.074±0.022,0.049±0.012和0.019±0.011.结论:从羊膜中分离得到的HAEC表达CK18,且免疫原性较低.
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高血压合并冠心病患者平滑肌细胞内Ca2+水平和血管紧张素Ⅱ1型受体表达的观察研究
目的 观察高血压合并冠心病患者与正常血压冠心病患者平滑肌细胞内Ca2+水平和血管紧张素Ⅱ1型(AT1)受体的表达情况.方法 ①收集首都医科大学附属北京安贞医院心脏外科行冠状动脉旁路移植术患者术中剩余大隐静脉,进行细胞培养,分为高血压搭桥组和正常血压搭桥组.②用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察不同浓度的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)分别刺激后2组的平滑肌细胞内游离钙浓度的变化情况.③提取培养的平滑肌细胞总RNA、RT-PCR,观察2组AT1受体的表达情况.结果 经AngⅡ刺激后人平滑肌细胞内Ca2+均迅速升高.在高血压搭桥组AngⅡ刺激后平滑肌细胞胞内Ca2+荧光吸光度较正常血压搭桥组明显升高(P＜0.05).在平滑肌细胞观察到高血压搭桥组AT1受体表达较正常血压搭桥组略高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 AngⅡ刺激后人血管平滑肌细胞存在胞内Ca2+的变化.高血压冠心病患者和正常血压冠心病患者平滑肌细胞存在AT1受体表达差别.
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椎间盘细胞培养的研究进展
椎间盘退行性变(椎间盘退变)是临床的常见病,对椎间盘退变病因和治疗的研究是当前脊柱外科研究的热点.椎间盘细胞培养技术为椎间盘退变机制研究提供重要的研究平台,也是椎间盘组织工程学、椎间盘基因或药物治疗等研究的起始点和关键点.
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胸椎黄韧带骨化患者黄韧带细胞的体外培养及初步鉴定
目的 探讨胸椎黄韧带骨化的发病机理.方法 2004年3月-2004年12月对8例行后路减压的下胸椎黄韧带骨化患者(男性5例,女性3例,平均年龄55岁)进行术中取材,采用组织块培养法,体外培养下胸椎黄韧带骨化患者非骨化区域的黄韧带细胞,并进行细胞化学,免疫细胞化学等方面研究;同时对7例急性外伤性下胸椎压缩骨折行胸椎后路减压术的患者(男性5例,女性2例,平均年龄28岁)进行术中取材,体外培养青壮年患者的下胸椎黄韧带细胞作为正常对照.结果 体外成功地培养出黄韧带细胞15株,其中骨化患者黄韧带细胞8株(OLF1～OLF8),正常黄韧带细胞7株(NLF1～NLF7),黄韧带细胞可以在体外增殖和传代,通常正常黄韧带生长较慢,而骨化患者的黄韧带细胞则生长较快,并且可形成典型的钙结节样结构;80%以上的细胞呈碱性磷酸酶(ALP)强阳性反应;细胞内的ALP活性及其合成的骨钙素(BGP)含量均较正常对照组明显升高;细胞浆有BMP-2与TGF-beta1的阳性表达,表明体外培养的下胸椎黄韧带骨化患者非骨化区域的黄韧带细胞呈现典型的成骨细胞表型特征:而正常黄韧带细胞主要为成纤维细胞表型.结论 胸椎黄韧带骨化患者的非骨化区域中存在大量具备典型的成骨细胞表型特征的细胞,可能被骨形成蛋白等骨生长因子所调控.
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淫羊藿甙对MC3T3-E1细胞Smad1,5作用的实验研究
目的 检测淫羊藿甙(icariin,ICA)对MC3T3-EI中Smad1,5 mRNA及蛋白的影响.方法 DMEM高糖、胎牛血清培养下的MC3T3-E1细胞按ICA刺激浓度0、10、40及80 ng/ml分为四组,各组接种于6孔板中,接种细胞数目约为3×105个/孔,分别于给药后24、48及72 h,用半定量RT-PCR技术测定Smad1,5 mRNA的量,以Western blot评价Smad1,5蛋白的量.并于给药72h后用免疫组织化学定位Smad1,5蛋白的表达.采用SPSS 13.0软件进行统计学分析.结果 RT-PCR显示ICA刺激24 h后,0、10、40、80 ng/ml各组Smad1.5 mRNA量的表达无统计学差异;刺激48 h后,0 ng/ml组Smad1mRNA表达量检出极少,Smad5 mRNA未检出;至72 h时,0 ng/ml组二者均未检出,而10、40、80 ng/ml各组在刺激48、72 h时,Smad1,5 mRNA保持较高水平,各组Smad1,5 mRNA的表达量较0 ng/ml组具有统计学意义.Westem blot蛋白印迹显示10、40、80 ng/ml各组的Smad1蛋白表达于不同时间点较0ng/ml组明显增加,0 ng/ml组仅于刺激72 h后少量检出.Smad5蛋白表达除0 ng/ml组外,于10、40、80ng/ml各组在不同时间点均有检出,较0 ng/ml组具有统计学意义.免疫组织化学显示10、40、80 ng/ml组,于胞质及核内Smad1,5蛋白的表达较0 ng/m组均增多.结论 淫羊藿甙可能通过上调Smad1,5mRNA及蛋白的表达来促进成骨细胞分化.
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人外周血内皮祖细胞分离培养与鉴定
目的 探讨人外周血内皮祖细胞体外分离培养和诱导分化的实验方法,为其在神经系统疾病中的应用提供理论依据.方法 抽取健康成年男性志愿者外周血10ml,密度梯度离心获得单个核细胞,经体外培养后于倒置相差荧光显微镜下观察细胞生长情况及形念变化;免疫荧光染色榆测细胞表面标志物CD133、CD34和凝血囚子Ⅷ表达水平;流式细胞术检测CD133-FITC和CD34-PE双阳性细胞所占比例及CD34-PE单阳性细胞所占比例.结果 倒置相差荧光显微镜下观察,人外周血单个核细胞经体外培养至第2天时,呈贴壁生长;至第4～6天时细胞集落形成,集落周围有内皮样细胞,细胞质和细胞膜呈红色和绿色双色荧光,细胞核呈蓝色荧光,提示内皮祖细胞特异性吸附Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的Ⅰ型荆豆凝集素,具有内皮细胞功能.免疫荧光染色CD133、CD34和凝血因子Ⅷ表达阳性;流式细胞术检测CD133-FTTC和CD34-PE双阳性细胞所占比例为38.30%,CD34-PE单阳性细胞所占比例为82.60%.结论 初步确立人外周血内皮祖细胞体外分离培养和诱导分化的实验方法,为内皮祖细胞的移植研究奠定了基础.
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临床教学医院研究生细胞培养技术的教学实践与探索
细胞培养技术是生命科学研究各个研究领域的基本技术，也是医学院研究生必备的实验技能。根据研究生教学情况，对细胞培养实验的教学方法、学生能力和素质培养及常见问题和应对措施进行了一些思考和总结。
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防御素5和LL37真核重组质粒构建及转染人阴道上皮细胞的研究
目的:构建防御素5(HD5)和LL37的真核重组质粒并瞬时转染人阴道上皮细胞,以期探讨阴道上皮细胞抵抗微生物感染的机制.方法:(1)从人阴道上皮细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HD5和LL37的cDNA,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1 (+)-EGFP中、构建重组质粒pcDNA3.1 (+)/HD5-EGFP和pcDNA3.1(+ )/LL37-EGFP.(2)经组织块法原代培养入阴道上皮细胞并传代,将2种质粒分别或联合转染人阴道上皮细胞,转染6、12、24和48 h后,采用荧光显微镜检测细胞转染情况,ELISA方法测定细胞培养上清液中HD5及LL37的表达情况.结果:成功构建了pcDNA3.1( +)/HD5-EGFP和pc DN A3.1(+ )/LL37-EGFP真核表达载体,实现了HD5和LL37在阴道上皮细胞中表达,细胞培养上清中有HD5和LL37蛋白分子表达,且在转染24h时表达量高.联合转染组的HD5和LL37水平高于单独转染组,单独转染组高于未转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.001).LL37组和联合转染组的LL37水平,联合转染组的HD5水平均是6h时分泌低,24h达高峰,然后呈下降趋势.HD5组的HD5水平随时间增加而呈增加趋势.结论:HD5和LL37成功转染人人阴道上皮细胞并成功表达,为研究重组HD5和LL37的抗菌功能及阴道上皮细胞先天免疫机制奠定了基础.
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胃癌细胞的制作对MDR-1免疫组化显示性的影响
目的:探讨胃癌细胞的制片和复染对MDR-1免疫组化显示性的影响.方法:培养胃癌SGC7901和耐药SGC7901/VCR细胞.均制作细胞滴片和爬片,抗MDR-1抗体免疫组化染色,部分标本甲基绿复染,半定量分析免疫反应性.结果:在同一制片中,无论滴片或爬片,复染标本的每种细胞MDR-1免疫反应性高于未复染者(P<0.01);对于同一种细胞不论是否复染,细胞滴片标本的MDR-1免疫反应性高于细胞爬片者(P<0.01);在同一制片和染色的情况下,SGC7901和SGC7901/VCR细胞的MDR-1表达水平不同(P<0.01),但变化趋势一致.结论:胃癌细胞的滴片比爬片有更好的MDR-1免疫组化显示性.
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小鼠前脂肪细胞3T3-L1培养与四联诱导分化方法的探讨
目的：改进小鼠前脂肪细胞3T3-L1的培养并诱导分化为成熟脂肪细胞的方法。方法使用含有10％胎牛血清（FBS）的高糖型DMEM液体培养基常规培养小鼠前脂肪细胞，2~3 d换液1次。细胞按诱导分化方式的不同分为三联诱导组和四联诱导组。三联诱导组诱导分化培养基Ⅰ成分为常规培养基基础上加用人胰岛素10 mg/L，1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（IBMX）0.5 mmol/L，地塞米松（DEX）1.0μmol/L；四联诱导组诱导分化培养基Ⅰ的成分为在三联诱导组基础上加入吲哚美辛0.1 mmol/L。2组均诱导分化培养基Ⅰ培养2 d，连续诱导2次后换用诱导分化培养基Ⅱ，成分为：高糖型DMEM培养基含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素混合液，人胰岛素10 mg/L。培养2 d，连续诱导2次。倒置显微镜和油红O染色观察诱导前及诱导后2组细胞的形态变化。结果小鼠前脂肪细胞3T3-L1状态良好，呈现铺路石状生长，均匀布满培养瓶底，2 d传代1次。四联诱导组诱导分化结果优于三联诱导组。三联诱导剂诱导前脂肪细胞后，细胞形态并未发生明显变化。四联诱导剂诱导前脂肪细胞后，可达到90％以上的成熟脂肪细胞。成熟的脂肪细胞呈圆形，有大量脂滴聚集，油红O染色显现橘红色。结论在三联诱导基础上加入吲哚美辛的四联诱导法可以更好地促进脂肪前体细胞分化。
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大鼠骨髓间充质干细胞的培养、扩增与鉴定
目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法,探讨体外培养MSCs的生物学特性.方法:采用密度梯度离心法和贴壁筛选法纯化MSCs,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果:原代MSCs呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状排列.传代后大都均匀分布生长,细胞生长迅速,倍增时间约45.5 h.流式细胞术鉴定表明,培养的第3代和第5代MSCs CD44、CD29阳性,CD45和CD34阴性.结论:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法可成功分离和培养大鼠的骨髓MSCs,MSCs可以作为组织工程中种子细胞的来源.
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人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养
目的:建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、鉴定的高效方法.方法:胰酶消化法从脐静脉获得HUVEC,观察其形态并传代培养,检测其摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AcLDL)的情况,传3代流式榆测内皮细胞特异性表达.结果:消化分离的细胞呈小圆形且聚集成团;2h细胞开始贴壁,呈条索状;7d细胞增多呈漩涡样生长;此后细胞继续增多接近融合,呈铺路石样改变.流式检测细胞高表达血管内皮细胞特异性标志CD144、vWF、CD31,部分表达CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达.镜下发现贴壁细胞原代、第5代摄取Dil-AcLDL,胞浆呈现红色荧光,提示为有活性的内皮细胞.结论:利用胰酶消化法能从人脐静脉获得大量内皮细胞,体外培养后能成功增殖传代.
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大鼠肝细胞的原代培养及鉴定
目的:探讨大鼠肝细胞原代培养的方法及细胞的鉴定.方法:采用胶原酶消化获取大鼠肝细胞进行纯化、培养,并采用免疫组织化学方法对其进行鉴定.结果:培养的肝细胞产量高、活力好,用相差显微镜对不同生长时期的肝细胞进行观察证实了细胞贴壁后变平变薄,双核细胞和多核细胞呈岛状连接的形态学特性,采用抗大鼠细胞角蛋白(ck18)的特异抗体进行免疫组化细胞爬片鉴定,经SP染色DAB显色后,阳性着色部位在胞浆呈棕黄色颗粒,阴性对照未见着色.结论:成功地体外培养了大鼠肝细胞并对其进行了鉴定,为进一步的实验研究奠定了基础.
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共培养体系中小鼠囊胚对人卵巢癌细胞系HO-8910PM的影响
目的:观察两种具有侵袭特性的小鼠囊胚细胞与人卵巢癌细胞在相同的体外微环境下,动态的相互作用和整体生物学行为变化.方法:建立小鼠囊胚与人高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM体外共培养模型,应用MTT法检测HO-8910PM细胞黏附率的改变;应用Transwell体外细胞侵袭实验观察HO-8910PM细胞体外侵袭及趋化性运动能力的变化;应用RT-PCR检测HO-8910PM细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1、TIMP-2 mRNA的表达.结果:癌细胞与小鼠囊胚共培养24 h后,大部分囊胚开始边脱带边黏附,推开底层的癌细胞,在囊胚与肿瘤细胞间形成了明显的界限.共培养组的HO-8910PM细胞的黏附率低于对照组.Transwell小室体外侵袭实验及体外趋化性运动实验显示,共培养组穿过滤膜的细胞数明显少于对照组.共培养组MMP-2、MMP-9 mRNA的表达及MMP/TIMP较对照组明显下降,TIMP-1、TIMP-2mRNA的表达略有增加.结论:当人HO-8910PM细胞与小鼠囊胚共培养时,肿瘤细胞失去了特有的侵袭性;小鼠囊胚能显著降低HO-8910PM细胞的黏附、体外侵袭能力、运动迁移性及MMP-2、MMP-9 mRNA的表达.
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心肌细胞的培养鉴定及β3-AR蛋白提取方法的比较
目的：优化培养乳鼠心肌细胞的技术，筛选出简便、准确、特异的提取心肌细胞β3-肾上腺素能受体（β3-AR）膜蛋白的方法。方法使用Ⅱ型胶原酶和差速贴壁法收集心肌细胞，分别用总蛋白法、超速离心法、试剂盒法提取心肌细胞β3-AR膜蛋白；BCA法进行蛋白定量；Western blot法检测蛋白样品中β3-AR和GAPDH相对含量及提取蛋白的特异性。结果优化心肌细胞的培养方法可以使所得细胞产量大、浓度高，满足后续实验。试剂盒法提取蛋白的浓度（8.26±0.29）g/L＞总蛋白法提取法的（5.12±0.47）g/L＞超速离心法的（3.20±0.37）g/L，差异均有统计学意义。Western blot检测结果示，试剂盒提取法所得β3-AR膜蛋白含量（0.22±0.05）＞超速离心法（0.09±0.03）＞总蛋白提取法（0.01±0.01），差异均有统计学意义。结论优化培养心肌细胞的方法可获得高产量、高纯度的细胞。试剂盒提取法可有效提高β3-AR膜蛋白的浓度和特异性。
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人脐带间充质干细胞和大鼠激活态雪旺细胞联合培养的实验研究
目的:探讨体外分层共培养条件下大鼠激活态雪旺细胞对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)生长及分化的影响.方法:分离、培养人脐带间充质干细胞和大鼠激活态雪旺细胞,通过Millicell小室实现两者体外共培养,根据共培养与否分为共培养组与对照组,通过巢蛋白(Nestin)、神经丝蛋白200(NF200)免疫荧光染色分析干细胞分化情况.结果:共培养组两种细胞在Millicell小室分层共培养条件下,hUCMSCs逐渐出现类似神经细胞的形态,对照组形态无明显变化.共培养组中hUCMSCs表达神经干细胞标志物Nestin,共培养1d后逐渐降低,而对照组仅低表达Nestin,共培养8h～7d,两组间差异有统计学意义(P＜0.01)；共培养组细胞共培养1d后hUCMSCs表达神经元标志物NF200,而对照组始终不表达NF200.结论:人脐带间充质干细胞有向神经细胞分化的能力,分层培养条件下大鼠激活态雪旺细胞可促进其神经方向分化.
