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二甲基亚砜、二甲基酰胺、甲醇、乙醇四种溶剂对Hela细胞培养干预效应研究
目的：观察二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、乙醇四种常用有机溶剂对Hela细胞生存率的影响，为开展体外细胞干预实验研究选择溶剂种类和浓度提供参考。方法：采用MTT法检测四种溶剂各9个浓度下Hela细胞的存活率；在此基础上采用AnnexinⅤ‐FITC／PI双标记流式细胞术，观察8种不同浓度的乙醇对Hela细胞凋亡的影响。结果：四种有机溶剂不同浓度时对Hela细胞生存率产生不同影响，DMSO佳浓度为0．5％；DMF佳浓度0．1％，甲醇的佳浓度0．1％～0．5％；Hela细胞的存活率和凋亡结果均表明乙醇作为有机溶媒的佳浓度0．25％。结论：DMSO、DMF、甲醇、乙醇四种溶剂对Hela细胞活性和生存率存在负向影响，程度从小到大依次为乙醇、DMSO、DMF、甲醇，用于体外细胞培养的浓度大均不可超过0．5％；乙醇是体外细胞培养中较为理想的溶剂，但浓度不可超过0．25％，刺激时间不可超过12h。
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大鼠腺垂体细胞的体外培养和鉴定
目的:探讨大鼠腺垂体细胞体外培养的技术.方法:选用成年雌性SD大鼠,取腺垂体进行单细胞原代培养,动态观察培养细胞在体外生长的情况,并利用免疫细胞化学染色技术进行鉴定.结果:①细胞形态学观察:腺垂体细胞呈圆形,折光性较强,边缘完整清楚有亮晕.培养2～4d,腺细胞仍为圆形,大部分直径减小,可见少量体积大的细胞,散在分布.培养7d以后,细胞开始变平、聚集成细胞簇.②免疫细胞化学染色:对体外培养1d后的成年大鼠垂体细胞进行LH免疫细胞化学染色鉴定.LH阳性细胞体积大,散在分布,数目较少,约占2%～3%;阳性产物位于胞质内,呈棕黄色.结论:①纯采用机械分离也可以获得理想的腺垂体单细胞悬液;②培养1周内的腺垂体细胞外形变化不大,但绝大部分体积变小,有聚集的趋势;③大而散在的细胞为LH阳性细胞,约占腺垂体细胞的2%～3%.本实验为腺垂体细胞的体外研究提供形态学基础.
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浅谈研究生细胞培养技术课的教学
细胞培养技术巳成为医学研究中普遍应用的手段,是高等医科院校的研究生基本技能培养中一门不可缺少的课程.就该课程在教学实践中,如何使学生更好地掌握和熟悉细胞培养技术,提高教学效果的几个方面做一探讨.
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细胞培养实验课的课前准备与课堂实施
细胞培养技术广泛应用于科研、教学及临床研究试验,是医学生必须掌握的一项技术.只有实验课前充分准备,课堂上合理实施,才能让学生在有限的课时内对细胞培养技术有一个全面了解,进而为以后的科学研究打下良好基础.
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组织工程皮肤的构建及其在经皮吸收中的应用
查阅了近20年来的文献,就组织工程皮肤的构建及其在经皮吸收中的应用进行了综述,提出体外培养细胞构建组织工程皮肤成为促进皮肤缺损创面愈合、提高创面修复质量的新途径.
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酶消化法分离培养家兔血管平滑肌细胞
目的 探讨胶原酶分离并培养家兔血管平滑肌细胞的方法.方法 取家兔腹主动脉,0.2%胶原酶I消化分离血管平滑肌细胞并进行培养,相差显微镜观察培养细胞的形态,免疫组化染色法检测细胞胞浆内α-肌动蛋白(α-actin)的表达.透射电镜观察血管平滑肌超微结构.结果 相差显微镜下细胞呈长梭形,未见明显异型细胞,α-actin胞浆染色阳性细胞数占总细胞数的99%以上.电镜显示VSMC内肌丝丰富,线粒体、高尔基复合体等细胞器较少,VSMC呈现分化的收缩表型.结论 胶原酶可消化分离培养血管平滑肌细胞,且有成活细胞数多、传代周期短的特点,可用于血管平滑肌表型研究.
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α晶体蛋白对活化视网膜小胶质细胞iNOS生物活性的影响
目的 观察α晶体蛋白对脂多糖(LPS)诱导活化的视网膜小胶质细胞增生及iNOS生物学活性的影响. 方法 以离体培养的小胶质细胞为对象,经细胞免疫荧光及流式细胞仪鉴定纯度,用不同浓度LPS和α晶体蛋白干预,MTT法检测α晶体蛋白对视网膜活化小胶质细胞活力的影响；RT-PCR法测定NO浓度,观察小胶质细胞分泌iNOS的表达变化. 结果 原代培养的小胶质细胞经GSA-IB4免疫组化鉴定及CD11b流式细胞仪鉴定纯度分别达到94.15％和93.34％,10-4 g/L α晶体蛋白可以抑制10-6g/L LPS对视网膜小胶质细胞的活力(P＜0.01)；联合用药组iNOS蛋白质量浓度及mRNA表达量明显降低(P＜0.05). 结论 在病理情况下,α晶体蛋白可以通过抑制小胶质细胞产生NO、iNOS,减轻其对视神经损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglial cells,RGCs)的损害.
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少突胶质前体细胞的培养及细胞缺氧缺糖模型的建立
目的 获取高纯度的大鼠少突胶质前体细胞系并建立细胞缺氧缺糖模型.方法 采用振荡分离纯化法和化学限定无血清培养基在体外获取纯化的大鼠少突胶质前体细胞,免疫荧光法对各分化阶段特异的表面抗原A2B5、O4、O1进行细胞鉴定.利用无糖培养基和连二亚硫酸钠造成O4阳性的少突胶质前体细胞的缺氧缺糖损伤,观察细胞的形态学改变,MTT法测细胞存活率.结果 获得纯度95%以上的大鼠少突胶质前体细胞,O4阳性少突胶质前体细胞出现缺氧缺糖损伤的形态学改变,并随缺氧缺糖时间延长而加剧;细胞存活率随缺氧缺糖时间的延长逐渐下降,30、60 min和90 min细胞存活率均低于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 振荡分离纯化法是体外培养大鼠少突胶质前体细胞的可靠方法,利用无糖培养基和连二亚硫酸钠可以建立细胞缺氧缺糖模型.
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Nogo-A在体外培养的少突胶质前体细胞的表达
目的 观察Nogo-A在少突胶质前体细胞的表达和细胞定位.方法 采用改良振荡分离纯化法及化学限定培养基体外培养少突胶质前体细胞,并用其特异性抗体A2B5、O4、O1用免疫荧光法作细胞鉴定.然后在相应的少突胶质细胞分化阶段用免疫荧光法观察Nogo-A的表达.结果 Nogo-A在细胞分离纯化培养后的1、2、4 d均有阳性表达,阳性信号位于胞体及突起.结论 在少突胶质祖细胞及未成熟少突胶质细胞表面及突起上均表达Nogo-A,为早产儿脑白质损伤及神经系统后遗症的发生机制中的作用提供了实验室基础.
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烧伤创面水疱液对人骨髓间充质干细胞体外培养及表型转化的影响
目的 了解烧伤水疱液对人骨髓间充质于细胞(MSC)体外培养及表型转化的影响.方法 体外分离、培养、扩增、鉴定人骨髓MSC,收集烧伤患者伤后12、24、48 h水疱液,分别加入MSC培养液中.分为水疱液1组:MSC培养液中加入伤后12 h水疱液;水疱液2组:MSC培养液中加入伤后24 h水疱液;水疱液3组:MSC培养液中加入伤后48 h水疱液;对照组:常规培养.各组所加水疱液体积分数均为20%.观察水疱液微生物生长情况及各组MSC生长情况.流式细胞仪检测培养8 d时各组MSC中CD44、细胞角蛋白7(CK7)阳性表达率.结果 15个水疱液标本细菌、真菌培养均为阴性;各组MSC细胞形态无明显变化,但各水疱液组细胞数量均少于对照组,水疱液3组细胞数量下降明显.水疱液1、2、3组CD44阳性表达率分别为(83.0±3.1)%、(77.2±2.9)%、(65.1±2.3)%,均低于对照组[(89.5±3.2)%,P<0.01];水疱液1、2、3组CK7阳性表达率分别为(24.06±0.11)%、(16.41±0.09)%、(4.48±0.07)%,明显高于对照组[(3.87±0.04)%,P<0.01].结论 烧伤创面水疱液对MSC体外培养有明显的抑制作用,并具有一定的促进MSC表型转化作用.
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以活性复合真皮基质为载体构建组织工程皮肤的研究
目的 构建含活性真皮基质的组织工程皮肤. 方法将人成纤维细胞(Fb)与Ⅰ型牛胶原混合接种于猪脱细胞真皮基质(PADM)的表面,构建活性真皮替代物.其上接种人表皮细胞进行气-液面培养,获得组织工程皮肤,进行组织学观察. 结果 Fb在胶原内结构完整,与PADM形成复合真皮基质.所构建的组织工程皮肤表皮层结构与人正常皮肤相似,具备基底层、棘层、颗粒层和角质层,细胞之间有桥粒连接,细胞分化良好. 结论 Fb-胶原-PADM真皮替代物可作为较好的构建组织工程皮肤的真皮支架.
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胎儿附属物来源细胞的培养冻存
目的 研究从胎儿附属物中分离培养及冻存细胞的较佳方法,以期为组织工程、细胞治疗和基因治疗提供种子细胞.方法 取足月产胎儿脐带和胎盘,用酶消化法获得细胞,用相应培养液进行培养传代.将胎盘、脐带组织块冻存,检测加入不同浓度抗冻剂二甲亚砜的组织复苏后的活细胞率,透射电镜下观察其超微结构,并与新鲜组织进行比较;冻存培养所得人脐带血管周细胞和胎膜贴壁细胞的原代细胞,用免疫化学法检测冻存前后各自免疫表型的表达.结果 新鲜脐带组织活细胞率为67.0%,抗冻剂体积分数为5%、10%、15%、20%时,冻存复苏脐带组织的活细胞率分别为23.4%、55.5%、48.8%、31.8%.抗冻剂体积分数为10%时,冻存复苏组织与新鲜组织活细胞率接近(P＞0.05),体积分数为5%和20%时与新鲜组织该指标比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);透射电镜观察结果与之吻合.胎盘组织与脐带组织的情况类同.细胞冻存后免疫表型无明显变化.结论 本方法可以从胎儿附属物中分离培养出大量种子细胞,冻存复苏后细胞免疫表型未发生改变,抗冻剂体积分数为10%时效果好.
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人胎儿毛囊隆突细胞的培养方法及其向皮脂腺细胞诱导分化的初步研究
目的探讨简单快捷地获得大量人毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性的方法,观察其向皮脂腺细胞分化的可行性.方法用传统的器械分离法(简称传统法)和改进的消化分离法(简称改良法)对人胎儿毛囊隆突细胞进行分离培养,比较两种方法的细胞获得效率和细胞生长特性.在对毛囊隆突细胞进行诱导培养后,行抗上皮膜抗原(EMA)抗体免疫组织化学染色,以检测细胞EMA的表达情况.噻唑蓝(MTT)法检测细胞克隆形成率.用亲和素-生物素复合物(ABC)标记法行毛囊隆突细胞角蛋白19(K19)染色.结果传统法每小时可获得8～10个毛囊隆突,贴壁48 h后有细胞长出,贴壁率为40%～50%,培养14 d左右传代;改良法每小时可获得毛囊隆突100个左右,接种后12 h即可贴壁并有细胞长出,贴壁率30%,细胞生长迅速,7 d左右即可传代.毛囊隆突细胞诱导培养7 d后,细胞体积变大,随着时间延长,细胞进一步变大,细胞质中有脂滴样颗粒围绕在核的周围,细胞形状不规则.诱导培养14 d后,抗EMA抗体免疫组织化学染色呈阳性表达.改良法的细胞克隆形成率为(18.2±2.1)%,明显高于传统法[(12.7±3.4)%,P＜0.05].毛囊隆突细胞K19免疫组织化学染色呈阳性,其细胞分布满视野,细胞质内含有大量棕色颗粒.结论改良法可以获得大量毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性,在体外诱导条件下,具有向皮脂腺细胞分化的潜能.
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无血清无滋养层培养的人角质形成细胞生物学特征
目的建立一种人角质形成细胞(HKC)无血清、无滋养层培养方法,观察用该方法培养的HKC的生物学特征.方法取5～10岁儿童及20～30岁成人(各5例)环切术后包皮,分为儿童组和成人组.采用二步消化法分离人包皮标本,检测其原代HKC获得数;用KC无血清培养液培养,光镜下观察HKC形态;荧光显微镜下鉴定HKC,并观察其生长速度;用噻唑蓝(MTT)法检测HKC生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期.结果儿童组原代HKC获得数为(1.780±0.010)×106/cm2,较成人组(1.490±0.120)×106/cm2高(P＜0.01).HKC形态学观察见刚分离的HKC为透亮的小圆形细胞,台盼蓝染色约94%细胞拒染,多次传代的HKC贴壁速度、贴壁率及透亮度明显增加;荧光显微镜下见细胞胞浆呈强黄绿色荧光,细胞核未着色,证明其为KC.儿童组HKC传代次数为(11.0±1.2)次,较成人组(9.2±0.8)次高(P＜0.05).HKC生长曲线无明显潜伏期,细胞增殖速度快,扩增倍数高.G1期细胞为36.15%,G2期细胞为25.17%,S期细胞为38.68%,细胞增殖指数为63.85%.结论无血清、无滋养层培养,是一种较理想的培养HKC的方法.
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芦荟多糖对体外培养人表皮细胞增殖的影响
目的观察芦荟多糖(AP)对体外培养人表皮细胞增殖的影响.方法体外培养人表皮细胞,依据所用DK-SFM培养液中AP含量的不同,将细胞随机分为25、50、100、200和400 mg/LAP组,对照组细胞仅加入等体积的DK-SFM培养液.通过倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态和超微结构,并计算细胞融合时间.应用噻唑蓝法、氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法、细胞计数法和流式细胞技术分别观察细胞存活率、3H-TdR掺入量、生长曲线分布情况及细胞周期,用以反映细胞增殖状况;通过检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率反映细胞损伤程度.结果倒置相差显微镜观察到,各组表皮细胞形态基本相似;透射电镜下观察到,100、400 mg/L AP组细胞增殖活跃,核内以常染色质为主,而对照组和25 mg/L AP组细胞则以异染色质为主.50～400 mg/L AP组细胞融合时间分别为(154±12)、(141±20)、(130±19)、(124±13)h,明显早于对照组(182±8)h(P＜0.01).从生长曲线上可见,100～400 mg/L AP组细胞增殖达峰值的时间较其他组提前1～2 d;25～400 mg/L AP组细胞存活率、3H-TdR掺入量均高于对照组.与对照组比较,25～400 mg/L AP组G0/G1期细胞所占百分比明显减少,G2/M期和S期细胞则明显增加(P＜0.01).200、400 mg/L AP组细胞LDH漏出率低于对照组及25、50 mg/L AP组(P＜0.01).结论高剂量AP对表皮细胞有保护效能,它通过诱导表皮细胞从G0/G1期进入G2/M期和S期促进细胞增殖.
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荧光蛋白表达对小鼠成纤维细胞系NIH3T3体外增殖能力的影响
目的观察不同荧光蛋白表达对体外培养的小鼠成纤维细胞系NIH3T3增殖能力的影响,为细胞示踪技术提供理论依据.方法将体外扩增培养的NIH3T3细胞随机分为对照组、pLEGFP-N1组、pEGFP-N1组、pDsRed2-C1组.对照组不作任何处理,其他3组分别采用逆转录病毒载体pLEGFP-N1和真核表达载体pEGFP-N1、pDsRed2-C1两种转染方式进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(RFP)标记,经G418筛选培养后,观察各组细胞荧光蛋白表达情况,并计算其阳性表达率;观察各组细胞贴壁率,绘制生长曲线并测定倍增时间.结果对照组NIH3T3细胞未见荧光蛋白表达;pLEGFP-N1、pEGFP-N1组均表达EFGP,pDsRed2-C1组表达RFP,而pLEGFP-N1组阳性表达率高于另外两组(P＜0.01).各组细胞均有较高的贴壁率.pEGFP-N1组细胞倍增时间为(39.6±0.6)h,pDsRed2-C1组(40.3±0.7)h,pLEGFP-N1组(36.5±0.7)h,均明显晚于对照组(27.9±0.6)h(P＜0.01).结论荧光蛋白表达对NIH3T3细胞体外增殖有一定程度的影响,但逆转录病毒载体抑制作用低于普通真核表达载体,可作为细胞移植时荧光蛋白标记的较好选择.
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人胎儿皮肤皮脂腺细胞和外泌汗腺细胞的分离培养及鉴定
目的建立人胎儿皮肤皮脂腺、外泌汗腺细胞的体外分离培养与鉴定方法.方法通过分离人胎儿皮肤皮脂腺腺体和外泌汗腺腺管,以DMEM/F12(1:1)为基础培养基,分别添加不同浓度的胎牛血清、表皮生长因子、L-谷氨酰胺、氢化可的松、霍乱毒素、青霉素、链霉素、重组人表皮生长因子、三碘甲状腺氨酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠作为皮脂腺细胞培养基及外泌汗腺细胞培养基,置入37℃、体积分数5%CO2孵箱中进行原代及传代培养.倒置相差显微镜下观察人胎儿皮肤皮脂腺、外泌汗腺细胞的形态及变化,并进行细胞克隆形成率测定.采用油红染色和细胞角蛋白(CK)4.62、上皮膜抗原(EMA)免疫组织化学染色对传代培养的皮脂腺、外泌汗腺细胞进行鉴定.结果分离的人胎儿皮脂腺腺体和外泌汗腺腺管可以在体外贴壁生长繁殖;其皮脂腺细胞的克隆形成率为2.7%,明显低于人胎儿角质形成细胞(8.0%,P＜0.01).人外泌汗腺细胞的克隆形成率为7.3%,与人胎儿角质形成细胞(7.7%)比较差异无统计学意义(P＞0.05).油红染色显示,皮脂腺细胞含有少量脂质小滴,CK4.62、EMA免疫组织化学染色均为阳性;外泌汗腺细胞CK7、CK19免疫组织化学染色均为阳性.结论用酶消化法和显微分离法可体外分离人胎儿皮肤皮脂腺、外泌汗腺细胞,两者均具备上皮细胞的标志和生物学特点,但皮脂腺细胞增殖速度较为缓慢.
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表皮细胞培养移植的现状与展望
表皮细胞培养技术于1975年首次建立.随着时间的推移,组织工程学和细胞分子生物学迅速发展,表皮细胞培养及移植的基础研究和临床应用也进入了新的阶段.
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纤维蛋白凝胶细胞培养模型的建立
创伤后的组织修复过程，在早期可表现为伤口收缩、肉芽组织形成及细胞外基质过度沉积等，在后期则表现为瘢痕形成及其异常增生，这些现象均与组织中成纤维细胞的生物学活动密切相关。近年来国内外学者利用细胞培养技术，在体外可控条件下对成纤维细胞进行了一系列研究，进一步丰富了创伤愈合的现代概念[1，2]。细胞培养方法主要有单层培养和立体培养法，本实验旨在建立并探讨成纤维细胞的立体培养模式。
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牙龈间充质干细胞的培养与鉴定
目的 分离培养人牙龈间充质干细胞,为进一步研究其对牙周炎的治疗作用提供基础.方法 采用酶消化法从牙龈组织中分离培养牙龈间充质干细胞,并通过克隆形成率、成脂成骨诱导分化、流式细胞术测定其增殖、多向分化能力及标志物的表达水平.结果 牙龈间充质干细贴壁生长,细胞与成纤维细胞相似呈长梭形,可形成明显集落.在特定的诱导条件下细胞可产生矿化结节和脂滴,干细胞标志物CD73、CD90、CD105表达均高于95％,造血干细胞标志物CD45表达低于2％.结论 采用酶消化法分离培养的牙龈间充质干细胞具有自我更新、多向分化能力,并表达干细胞标志物,为后期实验奠定了基础.
