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去甲斑蟊素对U87MG细胞增殖的影响
目的：探讨去甲斑蟊素对神经胶质瘤U87MG细胞生物学行为的影响。方法：用MTT法检测不同浓度的去甲斑蟊素对U87MG细胞增殖的抑制作用。用ELISA实验检测血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达水平。结果：MTT结果表明去甲斑蟊素对U87MG细胞的增殖有抑制作用，并随浓度增加抑制作用增强；ELISA实验提示去甲斑蟊素抑制U87MG细胞分泌VEGF蛋白。结论：去甲斑蟊素可以抑制U87MG细胞增殖，抑制肿瘤新生血管的形成。
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去甲斑蝥素主动肝靶向性药物设计研究进展
去甲斑蝥素是临床常用抗肝癌药物，抗肿瘤作用强，并且具有保护肝细胞、提高免疫功能等作用。为提高其对肝脏的靶向性，降低对其他脏器的毒性，近年来不断有学者进行去甲斑蝥素主动肝靶向性药物的设计，如单克隆抗体导向药物、去唾液酸糖蛋白介导的药物等。本文综述了近十年来对去甲斑蝥素主动肝靶向性药物的研究进展，为开发应用于临床的去甲斑蝥素主动肝靶向性药物的研究提供参考。
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斑蝥类化合物及其衍生物的基本概况和研究进展
本文概述了三大经典代表斑蝥类化合物的来源和物化性质，综述了其合成策略和基本合成路线。随后着重综述了斑蝥素和去甲斑蝥素及其衍生物的基本概况，及其近年来在抗肿瘤方面的研究进展，特别是其与抗癌机理密切相关的特异性结合酶，丝/苏氨酸蛋白磷酸酯酶（PP）中PP1、PP2A和PP2B的抑制活性和选择性的构效关系。总结了斑蝥类新型生物活性小分子的设计和发展方向。
关键词： 斑蝥素 去甲斑蝥素 Diels-Alder反应 磷酸酯酶抑制活性 结构修饰 -
去甲斑蝥素对喜树碱引起的白细胞减少症的缓解作用
目的:观察去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)能否缓解喜树碱(camptothecin,CPT)用药引起的骨髓抑制.方法:取Balb/c小鼠,采用概率单位法计算CPT半数致死量(median lethal dose,LD50).以1 mg·kg-1作为CPT给药剂量,使用全血分析仪检测24 h内不同时间点白细胞浓度变化,为后续联合用药提供检测时间点参考.随后取Balb/c小鼠随机分为6组,分别为空白组,CPT(1 mg·kg-1)组,NCTD低、高剂量(10,20 mg· kg-1)组,CPT(1 mg·kg-1) +NCTD(10 mg·kg-1)组和CPT(1 mg·kg-1) +NCTD(20 mg·kg-1)组.连续灌胃2周,采用眼球采血法,应用全血分析仪检测进行相关指标的测定.流式细胞仪检测各组小鼠骨髓中性粒细胞的差异.病理组织切片评估肠道的毒性情况.结果:CPT LD50为1 mg·kg-1.CPT单独给药后6h小鼠白细胞数目降至少.24 h内与CPT单独用药比较,CPT+ NCTD联合给药组白细胞、中性粒细胞数目明显上升(P＜0.05),嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等无明显变化.连续灌胃2周,比较CPT单独用药,CPT+ NCTD联合给药组白细胞数目明显上升(P＜0.05),其中淋巴细胞升高显著(P＜0.01),其他细胞无明显变化.流式细胞仪检测各组小鼠骨髓中性粒细胞的无明显差异,苏木素-伊红(HE)染色显示CPT主要毒靶器官小肠的病理变化短期、长期均不明显.结论:NCTD可减轻CPT用药引起的白细胞减少症,并没有增加其肠道毒性,为临床CPT应用,并减轻其毒性提供一定理论参考.
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去甲斑蝥素对12类主要人类癌症细胞株生长状态的影响
目的:确定去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)对12类,72种人类癌症细胞的半数抑制浓度(half maximalinhibitory concentration,IC50),并以此作为生长抑制效应的指标.方法:采用长时间细胞观察及功能分析系统(IncuCyteTM ZOOM),用不同浓度NCTD分别与癌细胞株共同孵育72 h,实时监测和观察细胞增殖情况,分析NCTD对12种人类癌症细胞的细胞毒性.此外,长时间细胞观察及功能分析系统的成像系统在每个时点进行拍照存档,展示了各细胞生长及存活的状态,并且进行实时观察.结果:NCTD对72株癌细胞系的生长抑制效应存在广泛的差异[IC502～66 μmol· L-,平均(24.63± 12.97)μmol·L-1].NTCD对不同细胞生长抑制的影响差异明显,体现在不同癌种之间以及同种癌种内不同个体之间.这充分反映了NTCD临床疗效个体化的特征,并提示了未来个体化治疗的可能性.肝细胞癌、胃癌、前列腺癌、白血病、中枢神经系统癌、肾癌、胆管癌细胞的细胞系IC50平均值均低于总平均值,且前列腺癌、白血病、中枢神经系统癌、肾癌、胆管癌细胞NCTDIC50平均值与肝癌细胞系和胃癌细胞系IC50平均值相近.结论:NTCD可能对前列腺癌、白血病、中枢神经系统癌、肾癌、胆管癌这几类癌症可产生显著疗效.
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斑蝥素及去甲斑蝥素对小鼠毒性靶器官的影响
目的:比较斑蝥素及去甲斑蝥素对小鼠的毒性作用及两者靶器官损伤程度的差异.方法:取Balb/c小鼠,采用概率单位法计算获得斑蝥素与去甲斑蝥素的半数致死量(median lethal dose,LD50).以1/2 LD50作为毒性研究给药剂量,连续灌胃给药2周.2周后取血检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天冬氨酸氨基转移酶(AST),尿素氮(BUN)水平,取肝、肾、小肠和膀胱进行病理组织学观察比较.结果:斑蝥素和去甲斑蝥素LD50分别为2.045,20.966 mg· kg-1.分别以1/2 LD50给药剂量给小鼠灌胃2周后,血清学检测结果表明,与正常组比较,斑蝥素组无显著差异;去甲斑蝥素可导致ALT,BUN水平显著性升高.肝、肾病理结果表明,与正常组比较,斑蝥素组肝肾轻微病变,去甲斑蝥素组可见肝脏炎性细胞浸润,肝细胞空泡变样,肾小球和小管弥漫性损伤.小肠病理结果表明,斑蝥素组导致肠道淋巴结肿大并分叶,去甲斑蝥素组症状较轻.膀胱病理表明,斑蝥素组发现血管炎症、膀胱移行上皮或黏膜层炎症反应,去甲斑蝥素组轻微移行上皮炎症反应.结论:临床前动物模型结果表明,去甲斑蝥素的毒性主要表现在肝脏和肾脏,斑蝥素的毒性作用主要表现为小肠和膀胱.
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去甲斑蝥素对环氧合酶-2过表达人大肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用
目的:探讨去甲斑蝥素对环氧合酶-2(COX-2)过表达人肠癌移植瘤裸鼠模型的抑制作用.方法:建立COX-2过表达的人肠癌移植瘤裸鼠模型,观察去甲斑蝥素(NCTD)对瘤体生长、裸鼠生存期和COX-2表达的影响.结果:成功建立COX-2过表达的移植瘤裸鼠模型,且HCT-116/COX-2实验组中COX-2蛋白表达显著上调,与对照组比较具有统计学差异(P＜0.05)；HCT-116/COX-2组的瘤体生长速度明显高于HCT-116组及空质粒组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；COX-2过表达组生存天数明显少于HCT-116组和空质粒组,差异有统计学差异(P＜0.05):NCTD对COX-2过表达裸鼠瘤体生长有明显的抑制作用,并且呈剂量依赖性；NCTD低剂量组、中剂量组、高剂量组裸鼠平均生存天数分别为(80.6±6.9)、(92.8±16.5)、(93.4±14.5)d,与HCT-116-COX-2(75.7±11.2)d比较均有统计学差异(P＜0.05)；NCTD对COX-2的表达有明显抑制作用,且呈剂量依赖性.结论:COX-2对人结肠癌裸鼠移植瘤的生长有明显的促进作用,且降低了裸鼠的生存期；NCTD能够抑制裸鼠移植瘤的生长,呈现剂量依赖性,并能延长荷瘤裸鼠的生存期,可能通过降低COX-2的表达抑制裸鼠结肠癌的生长.
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去甲斑蝥素立方液晶纳米粒制备及体外释放度研究
目的:探讨去甲斑蝥素立方液晶纳米粒的制备工艺.方法:采用不同方法制备去甲斑蝥素立方液晶纳米粒,紫外分光光度法测定药物包封率及体外释放度.结果:利用乳化法制备的立方液晶具有较好的包封率,粒径在140nm左右,粒度分布均匀,稳定性良好.结论:采用乳化法制备立方液晶纳米粒简便可行,去甲斑蝥素立方液晶具有良好的缓释作用.
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去甲斑蝥素联合环磷酰胺对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响
目的:探讨去甲斑蝥素联合环磷酰胺对荷瘤小鼠免疫功能的影响.方法:采用小鼠体内培养H22腹水肝癌细胞,接种健康小鼠,建立荷瘤小鼠模型,并给予去甲斑蝥素联合环磷酰胺治疗,观察计算睥脏指数、胸腺指数.CCK-8检测荷瘤小鼠经去甲斑蝥素联合环磷酰胺治疗后的脾脏淋巴细胞转化实验,流式检测经去甲斑螫素联合环磷酰胺治疗后荷瘤小鼠T细胞业群CD3+、CD4+、CD8+百分率,骨髓有核细胞凋亡率及细胞周期.结果:与环磷酰胺组比较,去甲斑蝥素联合环磷酰胺处理组的脾脏指数有升高趋势;在淋巴细胞转化实验中,不同剂量的去甲斑蝥素联合环磷酰胺均可提高淋巴细胞转化率,且与去甲斑蝥素的剂量呈正相关.低剂量的去甲斑蝥素联合环磷酰胺可有效提高T细胞亚群的百分比,CD3+(%)为11.4±3.13,CD4+(%)为7.3±2.94,CD8+(%)为2.88±0.51,与环磷酰胺组比较P＜0.05,与去甲斑螫素的浓度呈负相关.随着去甲斑蝥素剂量的增加,骨髓有核细胞凋亡率也逐渐升高.结论:低剂量去甲斑蝥素(1mg/kg)联合环磷酰胺可以降低单纯环磷酰胺化疗药对免疫系统的抑制作用.为临床用药剂量提供参考依据.
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去甲斑蝥素联合环磷酰胺对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响
3 讨论恶性肿瘤是危害人类生命和健康严重的疾病之一.中药可作用于肿瘤发生、发展的多个环节,具有多靶点、多环节、多效应的特点,其在抑制、杀伤肿瘤细胞、改善症状与体征,以及减轻放化疗不良反应、延长患者生存期等方面发挥重要作用;同时其具有不良反应低,能提高机体免疫力,不易产生耐药性等特点;其抗肿瘤活性已得到国际公认,为近年来研究的热点[4-6].
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去甲斑蝥素/粉防己碱双载药脂质体的制备工艺及体外释放性质考察
为优选去甲斑蝥素/粉防己碱双载药脂质体的处方及制备工艺,该实验以去甲斑蝥素介孔二氧化硅纳米粒(MSN-NCTD)及粉防己碱(Tet)为药物,采用薄膜分散-超声法制备双载药脂质体,以粒径和包封率为综合指标,通过正交试验考察磷脂胆固醇用量、超声时间、超声功率对处方工艺的影响;采用透析法考察脂质体的体外释放特性.结果表明制备的去甲斑蝥素/粉防己碱双载药脂质体,佳处方工艺为磷脂、胆固醇比2.5∶1,超声时间4 min,超声功率40％;NCTD与Tet的包封率分别为86.62％,79.19％;透射显微镜下可见脂质体外形良好,平均粒径(207.5±3.6) nm,Zeta电位(1.345 ±0.173) mV;NCTD与Tet的48 h累积释放率分别为85.14％,85.00％.实验结果证明薄膜分散-超声法制备双载药脂质体,包封率较高,粒径均匀,具有体外缓释特性.
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去甲斑蝥素诱导人T淋巴细胞白血病细胞株凋亡
应用TUNEL标记、DNA凝胶电泳以及光镜技术探讨去甲斑蝥素诱导人T淋巴细胞白血病细胞株(6T-CEM)凋亡规律.实验表明:0.625～5mg/L剂量的去甲斑蝥素作用6T-CEM 细胞24 h及10mg/L剂量的去甲斑蝥素作用6T-CEM细胞18h,台盼兰染色阳性率均在8.5%以下;10～80mg/L去甲斑蝥素作用6T-CEM细胞24h明显抑制6T-CEM 细胞生长.TUNEL标记显示:10～40mg/L剂量的去甲斑蝥素作用6T-CEM细胞24h及10mg/L剂量的去甲斑蝥素作用6T-CEM细胞超过18h后即出现典型的细胞凋亡特征 .一定剂量范围内的去甲斑蝥素可在直接杀伤作用较小的情况下明显诱导6T-CEM细胞凋亡,不会因细胞坏死而引起炎症反应,这对于去甲斑蝥素应用于临床将有十分重要意义.
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斑蝥素及去甲斑蝥素诱导人红白血病K562细胞凋亡的细胞学研究
目的研究抗癌药物斑蝥素及去甲斑蝥素诱导人红白血病K562细胞凋亡的细胞学变化特点.方法观察药物作用后K562细胞形态的动态变化、一般及超微结构特征,并用流式细胞术分析斑蝥素及去甲斑蝥素诱导K562细胞凋亡与细胞周期的关系.结果 2mg/L斑蝥素及10mg/L去甲斑蝥素作用24h,部分K562细胞质膜突起,染色质异常凝集,原位复染显示这些细胞质膜的通透性没有增强,DNA琼脂糖凝胶电泳呈现细胞凋亡特有的"梯子"状带纹.电镜下,加药处理组中部分细胞染色质凝集成块,没有核膜包被,部分细胞染色质靠核膜边集呈新月形,胞浆浓缩,内质网结构正常或有扩张,呈现典型的凋亡细胞形态.流式细胞术分析结合细胞形态学研究表明,斑蝥素及去甲斑蝥素诱导K562细胞凋亡与细胞G2/M期阻滞相关.结论斑蝥素及去甲斑蝥素能够诱导K562细胞凋亡,凋亡大部分发生在细胞周期的M期,也有少量发生在间期,是多点启动的.
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去甲斑蝥素诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡的研究
目的研究新型抗癌药物去甲斑蝥素抑制人肝癌(BEL-7402)细胞生长的机制. 方法从细胞的形态学观察和DNA琼脂糖凝胶电泳等方面考察去甲斑蝥素作用人肝癌细胞的特点,并进一步用免疫细胞化学及Western blotting等分析手段研究癌基因蛋白Bcl-2在此过程中的表达情况. 结果 10mg/L去甲斑蝥素作用人肝癌细胞24h,部分细胞出现固缩、细胞质膜突起、核染色质异常凝集等,并伴有膜包被的凋亡小体的形成.DNA琼脂糖凝胶电泳显示,处理组部分细胞的DNA已降解成以约200bp为基数的DNA片断,呈现典型的"梯状"带纹.免疫细胞化学及Western blotting分析显示该过程伴随癌基因蛋白Bcl-2表达的减弱. 结论新型抗癌药物去甲斑蝥素可以诱导人肝癌细胞发生凋亡,该凋亡过程与癌基因蛋白Bcl-2表达下调相关.
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去甲斑蝥素对环磷酰胺诱导的白细胞减少症模型大鼠骨髓造血功能的影响
目的:探讨去甲斑蝥素(NCTD)对环磷酰胺(CTX)诱导的白细胞减少症模型大鼠骨髓造血的影响及机制.方法:采用CTX腹腔注射法复制白细胞减少症模型,以NCTD干预模型大鼠,全自动血细胞分析仪检测外周血白细胞(WBC)数量,骨髓组织作切片HE染色观察病理改变,流式细胞术检测骨髓细胞增殖周期、凋亡率,免疫组织化学法检测骨髓组织中凋亡相关蛋白BCL-2、BAX的表达.结果:NCTD干预白细胞减少症模型后,外周血WBC显著升高;模型大鼠骨髓骨髓组织结构破坏,造血细胞明显减少,NCTD干预后促进骨髓组织细胞结构显著恢复;NCTD可促使白细胞减少症模型大鼠骨髓细胞增殖及周期的转化,显著抑制CTX所诱导的骨髓细胞凋亡与坏死,上调抑凋亡蛋白BCL-2表达,下调促凋亡蛋白BAX的表达.结论:NCTD可刺激CTX诱导的白细胞减少症模型大鼠骨髓造血,促进外周血白细胞水平的恢复,其机制可能与NCTD调控骨髓细胞周期、抑制细胞凋亡等有关.
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去甲斑蝥素对胆管癌RBE细胞α-Tubulin骨架蛋白及细胞周期的影响
目的：观察去甲斑蝥素对人胆管癌RBE细胞周期的影响及对微管蛋白（α-Tubulin）的作用。方法体外培养胆管癌RBE细胞，分别用不同剂量去甲斑蝥素处理，流式细胞学检测细胞周期的影响，免疫组化染色法观察α-Tubulin结构变化，Real-time PCR检测α-Tubulin mRNA转录水平变化。结果流式细胞学检测显示胆管癌RBE细胞随着药物浓度的增加，G2/M期阻滞作用增强，10、20、40μg/ml组与对照组相比具有统计学意义（P＝0.000，P＜0.01）。免疫组化染色法观察到去甲斑蝥素作用下，胆管癌RBE细胞α-Tubulin骨架结构被破坏，Real-time PCR证实去甲斑蝥素使胆管癌RBE细胞α-Tubulin转录水平减少，差异具有统计学差异（P＝0.002，P＝0.000，P＜0.01）。结论去甲斑蝥素可以通过破坏胆管癌RBE细胞Tubulin骨架、抑制α-Tubulin mRNA的表达，阻止纺锤体的形成，将细胞周期阻滞在G2/M期，导致生长抑制，是其抗肿瘤机制之一。
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斑蝥素和去甲斑蝥素抑制膀胱肿瘤细胞增殖的实验研究
目的：通过对比研究不同浓度斑蝥素（CA）和去甲斑蝥素（NCTD）对体外人膀胱肿瘤EJ、T24和鳞状细胞癌细胞（BSCC）增殖的抑制作用，明确药物效果、佳药物浓度其抗肿瘤细胞增殖的机制。方法使用不同浓度的CA和NCTD与肿瘤细胞共同培养，MTT实验计算细胞生长抑制率，进而选出抑制肿瘤细胞的有效药物及其佳浓度。选用佳浓度的佳药物与肿瘤细胞共同培养，不同时间收集细胞，电子显微镜及激光共聚焦显微镜观察细胞形态。结果 CA在体外对人膀胱肿瘤EJ、T24和BSCC细胞增殖有明显抑制作用，NCTD对于EJ和T24细胞有增殖有明显抑制作用，对BSCC细胞增殖的无明显抑制作用。在浓度小于40μmol/L、作用时间12～24 h的情况下，CA对EJ和T24细胞的增殖抑制作用具有明显的时间-效应和剂量-效应关系，24 h时药物半数抑制浓度（IC50）为20μmol/L；在浓度小于60μmol/L、作用时间24～48 h情况下，CA对BSCC的抑制作用具有明显的时间-效应和剂量-效应关系，48 h时药物IC50为60μmol/L。在浓度小于80μmol/L、作用时间24～48 h情况下，NCTD对EJ和T24细胞的增殖抑制作用具有明显的时间-效应和剂量-效应关系；24 h时药物IC50为60μmol/L。激光共聚焦扫描显微镜及电子显微镜观察证实CA和NCTD通过诱导膀胱肿瘤细胞凋亡进而抑制其增殖。结论 CA及NCTD均具有较好的抑制常见膀胱肿细胞增殖的作用，有望用于浅表膀胱肿瘤电切术后的膀胱灌注化疗；且CA对BSCC细胞增殖具有较好的抑制作用，有望用于膀胱肿瘤电切标本中伴发 BSCC患者的膀胱灌注化疗。
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去甲斑蝥素对人胆囊癌GBC-SD细胞系MMP2、TIMP2和MMP2/TIMP2的影响
胆囊癌是一种浸润转移早、预后差的恶性肿瘤.目前的治疗方法如手术、化放疗,疗效均不甚满意.本研究探讨中药斑蝥的低毒提取物去甲斑蝥素对人原发性胆囊癌GBC-SD细胞的基质溶解相关基因蛋白MMP2、TIMP2和MMP2/TIMP2的影响,以探讨其抗侵袭转移机制.
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去甲斑蝥素对荷瘤裸鼠胆囊癌移植瘤增殖和凋亡的体内干预实验
目的探讨去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)对荷瘤裸鼠胆囊癌移植瘤增殖和凋亡的影响.方法建立裸鼠人胆囊癌种植瘤模型,实验分为对照组、5-FU组、NCTD组、NCTD+5-FU组4组.测定移植瘤大小、生长曲线和抑瘤率,应用流式细胞术、光学和电子显微镜观察移植瘤细胞的细胞周期、凋亡率和形态学改变.数据统计采用SPSS11.5软件包方差分析或x2检验.结果NCTD对荷瘤鼠的半数致死量(LD50)为139.96 mg·kg-1.应用1/5LD50即可使裸鼠移植瘤明显缩小(5.61±0.39 vs.9.78±0.61 cm3,P=0.000),抑瘤率增高(42.63%vs.0,P=0.012);移植瘤细胞周期中S期细胞明显减少(43.47%±2.83%vs.69.85%±1.96%,P=0.000),凋亡率上升(5.49%±0.59%vs.15.08%±1.49%,P=0.000);与5-FU合用时上述作用更明显(P=0.000).NCTD作用后的移植瘤细胞经光镜检查见胞核固缩,核碎裂等现象;电镜显示典型的凋亡细胞及凋亡小体.结论NCTD可明显抑制荷瘤裸鼠胆囊癌移植瘤的增殖和生长,若与5-FU合用呈协同效应,可加强其抗癌作用.
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去甲斑蟊素诱导T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡作用及其机制
目的 研究去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)在体外对急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞凋亡的作用及其机制.方法 取对数生长期的Jurkat细胞分别加入不同浓度的NCTD和(或)10 mg/L的长春新碱(VCR),倒置显微镜下观察不同时间Jurkat细胞形态、密度及结构的变化;采用MTT比色法测定NCTD及VCR两种药物作用于细胞72 h后对细胞增殖抑制作用的影响;实时荧光定量RT-PCR法对p53及survivin基因表达量进行检测.结果 NCTD及VCR作用组细胞形态出现不规则,胀大、变形现象明显,分布稀疏,大量细胞死亡,两者在相同时间点上对细胞的影响无明显差别.MTT法检测结果表明:NCTD增殖抑制作用呈现时间-浓度依赖关系,佳浓度及时间在20 mg/L,作用72 h时.NCTD与VCR两者对Jurkat细胞均有抑制作用(P＜0.05),两者的抑制率相比无显著性差异(P＞0.05),且两者联合可增加细胞增殖抑制率(P＜0.05).应用实时荧光定量RT-PCR技术定量表达p53及survivin基因,结果显示NCTD组p53基因表达较对照组细胞株明显上升(P ＜0.001),相反survivin基因较对照组明显下降(P＜0.01).结论 (1) NCTD抑制Jurkat细胞株的增殖抑制作用具有时间-浓度依赖关系;(2)NCTD与VCR对细胞增殖均有抑制作用,两者的影响无显著性差异,且两者联合可增强对细胞的增殖抑制作用;(3)NCTD促进Jurkat细胞株细胞凋亡、抑制增殖的机制可能与上调p53基因表达量及下调survivin基因表达量有关.
