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携带DREAM基因小分子干扰RNA重组质粒的构建
背景:DREAM是一种多功能蛋白,在细胞中不同位置与不同靶蛋白结合,体外细胞培养和动物实验均证明DREAM参与了许多疾病的发病机制.目的:构建携带DREAM基因的小分子干扰RNA重组质粒.方法:设计并合成shRNA对应的两条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,转化感受态E.coli DH5α,获得阳性克隆进行PCR和测序鉴定.结果与结论:经PCR、酶切及测序证实,重组质粒pDC316-EGFP-DREAM-shRNA-U6片段大小为473 bp,其中插入的片断序列和位点与预期完全一致,说明pDC316-EGFP-DREAM-shRNA-U6重组质粒构建成功.
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pGL3-Claudin-1promoter荧光素酶报告基因质粒的构建及其功能鉴定
背景:Claudin-1是一种多功能蛋白,除了组成紧密连接封闭细胞间隙,它在转录水平的表达失调可能作为一种分子标志反映到恶性肿瘤的侵袭转移和预后中.目的:构建重组大鼠重组Claudin-1萤光素酶报告基因质粒.方法:设计和合成包含5'非转录区的约2 000 bp的脱氧核糖核酸链,经过限制性内切酶KpnⅠ和MluⅠ酶切后插入到pGL3-Basic载体中,并用感受态E.coli DH5α和Pmd18-T-simple载体筛选阳性样品.阳性克隆通过测序和PCR证实.实验分为4组:对照组,阳性对照组(pGL3-promoter质粒转染),阴性对照组(转染pGL3-Basic质粒),实验组(转染pGL3-Claudin-1 promoter质粒).将质粒转染293T细胞检测Claudin-1启动子活性.结果与结论:重组质粒DNA测序结果采用NCBI blast比对与GenBank(gi162750811)中大鼠Claudin-1基因启动子序列完全匹配.重组萤光素酶报告基因转录活性检测与pGL3-Basic质粒相比,重组pGL3质粒转录活性明显增强 (P < 0.001).经过测序和转染结果证实有效的pGL3-Claudin-1启动子质粒构建成功.
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六氟化硫微泡介导人脂联素基因兔主动脉内转染及表达
背景:超声微泡载基因传输技术是一种新兴起的定向传输基因技术.目的:构建含人脂联素基因脂联素的真核表达载体,采用六氟化硫微泡介导脂联素基因进行兔主动脉转染及表达,为脂联素用于体内干预动脉粥样硬化的研究奠定基础.方法:人心外膜脂肪组织提取总RNA 构建pcDNA3.1-脂联素重组体,通过瞬时转染人脐静脉内皮细胞验证载体构建是否成功.21 只大白兔随机分成对照组(n=6)和脂联素转基因组(n=15),脂联素转基因组经兔耳缘静脉注射pcDNA3.1-脂联素与六氟化硫微泡的混合物,诊断超声仪照射兔胸腹主动脉区域,于照射后2,7,14 d 取兔主动脉血管及血清,检测主动脉血管壁中脂联素基因的表达及血清中脂联素蛋白水平.结果与结论:pcDNA3.1-脂联素瞬时转染入人脐静脉内皮细胞可有效表达.六氟化硫微泡传输脂联素基因2 d 后即可检测到兔主动脉血管壁脂联素基因高表达,持续至14 d,且兔血清脂联素蛋白水平显著增加(P < 0.01).说明pcDNA3.1-脂联素重组体构建成功,六氟化硫微泡可在快速血流状态下,安全、高效传输脂联素基因入兔主动脉血管壁并有效表达与分泌至血浆.
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构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体
背景：腺病毒的表达时间有限，会限制目的基因的表达时间和表达量，不利于实验的持续进行，故文章选择慢病毒作为载体，与目的基因大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因片段进行基因重组。
目的：探讨构建含有大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体的方法。
方法：根据GenBank中大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体序列(NM 145681.1)，设计出该基因的特异性引物Trail-AgeⅠ-F和Trail-AgeⅠ-R，用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因，AgeⅠ酶切将该基因克隆入真核表达载体GV218中，产生目的重组质粒，用脂质体 Lipofeetamine 2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体，3个质粒共同转染293T细胞，产生含有表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的慢病毒颗粒，收集病毒进行滴度鉴定，收集细胞提取蛋白进行基因表达情况的检测。
结果与结论：筛选出的克隆阳性菌测序获得肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，全长861 bp，与GenBank中发表的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体核苷酸序列完全一致。包装后的病毒LV-mTrail在转染2 d后收集病毒液，经PCR和Western blot方法鉴定，从基因和蛋白的层面均证实携带有目的基因肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因。孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2×109 TU/mL。提示大肠杆菌同源重组法能有效和方便地构建出含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体。关键词： 组织构建 组织工程 肿瘤坏死因子 相关凋亡诱导配体基因 慢病毒载体 重组质粒 PCR Western blot -
mCD20-腺病毒载体的构建
目的:构建编码鼠CD20(mCD20)基因的腺病毒载体,即AdmCD20重组质粒,为后续将其感染DC作为疫苗免疫小鼠做准备工作,为CD20基因治疗淋巴瘤的研究奠定基础.方法:实验于2006-03/2007-04在解放军北京军区总医院血液科实验室完成.运用分子生物学技术,利用本实验室保存的mCD20,以PCR凝胶电泳、酶切进行鉴定后,将该基因cDNA片段插入腺病毒穿梭质粒pDC315中,转化至高效感受态DH5a细菌细胞中进行扩增,提取质粒,获得重组质粒腺病毒穿梭质粒pDC315-mCD20,然后采用Ad MaxTM腺病毒载体包装体系,构建Ad5/35mCD20.结果:顺序成功重组pcDNA3.1-mCD20质粒,腺病毒穿梭质粒pDC315-mCD20,然后采用Ad MaxTM腺病毒载体包装体系成功构建编码鼠CD20基因的腺病毒载体.结论:表达mCD20基因的腺病毒载体构建成功,此方法准确可行,为后续实验奠定基础.
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地高辛标记人 TGF β1cDNA 探针的制备
用EcoRI/XhoI两种限制性内切酶在同一反应体系中对TGFβ1cDNA重组质粒联合酶切获得1.3Kb的酶切片段作为裸探针,比以往文献申报道的长度缩短约700bp,经地高辛标记获得较高的标记效率.本方法简化了操作步骤,并大大降低了cDNA探针的制备成本,不失为制备TGFβ1cDNA探针的好方法,为TGFβ1mRNA的检测提供了较好的工具.
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流行性乙型脑炎病毒结构蛋白编码基因的重组构建
目的:建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)C、prME,E等结构蛋白编码基因克隆.方法:病毒感染C6/36细胞,RT-PCR法依次获取该病毒结构蛋白基因并进行DNA测序分析,PCR克隆法将PCR产物分别构建于真核表达载体pcDNA 3.1的BamHI与EcoRI酶切位点并依次命名为pJC、pJME与pJE,通过DNA测序、电泳以及限制性内切酶分析加以鉴定.结果:JEV C、prME与E基因片段分别为380、2001以及1 500bp,各基因测序结果与发表的JEV JaGAr-01株相对应序列相一致,从重组质粒释出的插入子分别与各基因大小相符合.结论:pJC、pJME与pJE重组质粒分别含有C、prME与E蛋白编码基因.
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淋球菌膜蛋白疫苗的研究
目的:设计淋球菌膜蛋白疫苗并构建原核表达系统,测定表达蛋白的免疫活性.方法:PCR扩增淋球菌膜蛋白(PIA)基因片段,构建重组质粒,重组质粒宿主菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE分析PIA的表达情况.淋球菌标准株免疫BALB/c小鼠,体外凝集检测动物血清的免疫效果及ELISA法检测PIA的免疫活性.结果:成功构建表达PIA蛋白的重组质粒,SDS-PAGE电泳图上显示1条相对分子量(Mr)约为40KDa的新生条带,能与免疫血清发生特异性结合反应.结论:淋球菌膜蛋白疫苗原核表达系统的设计和构建正确,表达蛋白PIA具有免疫活性,为淋病疫苗的开发奠定了基础.
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柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒的构建
目的:构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒.方法:用RT-PCR技术,从柯萨奇B4病毒中钓取非结构蛋白P2C cDNA片段,克隆入PUCm-T载体,转化大肠杆菌DH5α,构建重组质粒.结果:以柯萨奇B4病毒的总RNA为模板,扩增出987 bp大小的片段,克隆入PUCm-T载体,用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切鉴定,与非结构蛋白P2C的PCR扩增产物片段大小一致.结论:成功地构建了柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒.
关键词： 柯萨奇B4病毒(CVB4) 1型糖尿病 非结构蛋白P2C 重组质粒 -
CD47重组质粒及其过表达重组大鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定
目的:构建CD47重组质粒并将其转染至大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs),建立稳定过表达CD47的BMMSCs,为研究干细胞治疗中逃避免疫监视的有关机制提供实验模型.方法:构建过表达CD47基因的质粒载体,转染至分离培养的大鼠BMMSCs,RT-PCR、Western blot分别检测干细胞CD47 mRNA、蛋白水平的表达,并完成功能检测.结果:成功构建了pYr-ads-4-ratCD47质粒,经酶切、测序结果表明pYr-ads-4-ratCD47重组质粒构建成功;RT-PCR、Western blot显示实验组转染至大鼠BMMSCs后CD47的mRNA和蛋白水平表达明显增高(P＜0.05);功能检测提示过表达CD47分子的BMMSCs成功逃避巨噬细胞吞噬.结论:经质粒介导可成功将大鼠CD47目的基因片段转染至大鼠BMMSCs,并能够在体外有效的过表达.
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TNFAIP8干扰质粒的构建及佳干扰效率质粒的筛选
目的：构建并筛选出干扰效率佳的TNFAIP8-shRNA-pSIREN-RetroQ干扰质粒。方法：通过生物软件选择3个TNFAIP8基因干扰位点，构建干扰质粒并测序验证，将干扰质粒及对照质粒分别转染至 A549细胞，通过RT-PCR、Western blot检测干扰效率。结果：经RT-PCR和Western－Blot证实TNFAIP8-shRNA-pSIREN-RetroQ干扰质粒能有效干扰并抑制细胞内TNFAIP8基因的表达，通过流式检测发现降低TNVAIP8表达可以提高细胞对aDR5 ScFv诱导凋亡的敏感性。结论：成功构建和设计了对TNFAIP8基因具有显著干扰效率的干扰质粒，为进一步研究TNFAIP8基因的功能奠定了基础。
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T细胞淋巴瘤DNA疫苗的实验研究
目的:研究T细胞淋巴瘤TCR Vβ DNA疫苗诱发小鼠体液免疫反应.方法:将BALB/C小鼠随机分为pcDNA3.1组、pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+质脂体组和全硫代CpG组,共4组(每组6只),双侧股四头肌注射疫苗免疫,于第0、2、4周各免疫1次,共3次.每次免疫前及免疫开始后至第8周,取鼠血,应用间接免疫荧光法检测小鼠抗体生成情况.结果:pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组小鼠血清中均产生了特异性抗体,抗体滴度在第4周开始增高,第6周时达到高峰.同一时间段相比,特异性抗体滴度后者显著高于前者.结论:证明了DNA重组质粒pcDNA3.1/TCR Vβ8可诱导小鼠产生特异性抗T细胞淋巴瘤TCR Vβ8抗体;CpG和脂质体增强了TCR Vβ8 DNA疫苗诱导的体液免疫反应.
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新城疫病毒HN基因重组体对人胃癌细胞BGC-823凋亡作用机制研究
目的本实验研究旨在探讨含新城疫病毒HN基因的重组质粒对人胃癌细胞BGG-823凋亡的联合作用机制.方法将含有HN基因的重组质粒pIRVP3IL-18HN经脂质体介导转染人胃癌细胞BGC-823,通过MTT方法检测细胞活力;电镜下观察细胞形态;罗丹明123和DCFA染色测定线粒体跨膜电位(△ψ)和活性氧(ROS)水平变化;底物染色反应检测Caspase-3活性.结果重组质粒pIRVP3IL-18HN转染人胃癌细胞BGC-823后,MTT法结果显示致肿瘤细胞死亡率升高,细胞活力下降;电镜观察肿瘤细胞呈现明显凋亡状态;与阴性空白质粒对照显示,线粒体△ψ下降,ROS水平升高;Caspase-3活性被激活.结论含新城疫病毒HN基因的重组质粒可以诱导人胃癌细胞BGC-823进入特定的凋亡程序,从而导致人胃癌细胞BGC-823的凋亡.
关键词： 新城疫病毒 HN基因 重组质粒 人胃癌细胞BGC-823 凋亡 -
DNMT3 a基因shRNA质粒表达载体的构建及其沉默作用
目的：以DNMT3a mRNA 保守序列为靶基因设计针对DNMT3a mRNA的siRNA序列和无效干扰对照序列（HK），并利用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil－1中，构建pGenesil－1－DNMT3a－shRNA、pGenesil－1－HK－shRNA重组质粒。方法应用转化技术将重组质粒转化到大肠杆菌 DH5a中，通过卡那霉素抗性筛选出阳性菌落后提取质粒进行酶切和测序鉴定，应用质粒转染技术转染耐顺铂肺腺癌 A549细胞（ A549－DDP），利用RT－PCR技术检测转染重组质粒24、48、72 h后 DNMT3a的沉默效率。结果测序结果与合成序列一致，重组质粒不能够被PstⅠ切开，转染pGenesil－1－DNMT3a－shRNA能够明显抑制DNMT3a的表达，抑制率分别达到25．5％，56．2％，63．4％，且呈明显时间依赖性，而 pGenesil－1－HK－shRNA无明显抑制作用。结论成功构建了DNMT3a基因shRNA及HK质粒真核表达载体，为进一步实验研究奠定了基础。
关键词： DNMT3A RNA干扰 小发卡RNA 重组质粒 A549-DDP细胞株 -
pcDNA3.1-HIF-1α重组质粒的构建及其初步鉴定
目的 探讨HIF-1 α与前列腺癌发病机制之间相关性提供研究工具.方法 采用Trizol法裂解细胞,提取HIF-1 α且以该RNA为模板逆转录为cDNA,然后行PCB处理扩增HIF-1 α基因功能片段区域,克隆至真核表达载体pcDNA3.1上,转化至大肠杆菌DH-5 α,小提质粒,酶切凝胶电泳鉴定,序列测定,经鉴定为正确序列后中抽质粒,采用Fugene试剂转染至前列腺癌细胞PC-3,经G418筛选,建立稳定表达HIF-1 α的前列腺癌细胞系pcDNA3-1-HIF-1 α-PC-3,采用Western印迹鉴定重组质粒的表达.结果 PCR扩增基因片段大小为2.89 kb,克隆至真核载体pcDNA3.1,酶切凝胶电泳可见两个条带,大小大约为5.3 kb和2.89 kb,与预期的大小相符合,序列测定与Cenbank公布的一致,Western印迹验证其在细胞内能表达.结论 重组质粒pcDNA3.1-HIF-1 α能够在前列腺癌PC-3表达,构建成功,为研究HW-1α与前列腺癌提供了一个工具.
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重组质粒Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3对移植静脉新生内膜的增生抑制作用
目的:观察重组质粒Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3对移植静脉内膜增生的影响,为预防冠状动脉旁路移植术后移植血管再狭窄提供新的方法.方法:40只雄性Wistar大鼠随机分为空质粒组和重组质粒组.每组20只.脂质体Lipofectamine 2000与该空质粒或者重组质粒混合15 min再与生物蛋白胶混合后,转染大鼠移植静脉(右颈外静脉中段),在3、7、14和28 d时,经左心室灌注4%甲醛并提取移植静脉,采用免疫组织化学方法(增殖细胞核抗原PCNA)检测移植静脉内膜血管平滑肌细胞(VSMCs)的增生及表达,以增殖指数表示.采用HE法检测移植静脉新生内膜增生病理形态学变化,在40倍镜下测量其内膜厚度.结果:免疫组织化学检测,术后7和14 d空质粒组移植血管管壁内膜层可见许多PCNA阳性细胞,重组质粒组PCNA阳性细胞数明显少于空质粒组.7 d时重组质粒组增殖指数(23.3±2.8)低于空质粒组(31.3±4.7)(P<0.05);14 d时重组质粒组增殖指数(15.6±0.4)低于空质粒组(27.2±5.7)(P<0.05).7 d时重组质粒转染组内膜厚度[(0.50±0.02)μm]明显低于空质粒组[(0.90±0.02)μm](P<0.05).结论:重组质粒Psilencer1.0-U6-siRNA-stat3 对冠状动脉旁路移植术后移植静脉内膜增生有明显的抑制作用.
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人纤溶酶真核表达重组质粒的构建
目的:构建人纤溶酶真核表达载体以用于抗栓、溶栓的研究.方法:人胎肝组织经PCR技术扩增人纤溶酶基因,定向克隆至真核表达质粒pC-DNA-3后测序.经测序鉴定正确后构建人纤溶酶真核表达重组质粒,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒的正确性.结果:目的基因PCR扩增产物为1740 bp,测序结果显示,目的基因PCR扩增产物与GenBank登记的序列完全相同.PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的人纤溶酶基因全长序列.结论:成功构建了含有人纤溶酶基因的真核表达重组质粒,并进行了鉴定.
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pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒的构建与蛋白表达
目的:通过基因重组方法构建pCMV-Myc-PIASxa质粒,在真核细胞中高效表达重组蛋白并进行检测.方法:用Sal Ⅰ和Not Ⅰ将PIASxβ片段从pGADT7载体中酶切后,利用DNA重组技术将其定向插入pCMV-Myc载体中.获得正确重组质粒后,瞬转CHO细胞系,用Western blotting检测Myc-PIASxβ重组融合蛋白表达.结果:经过酶切,片段回收,连接转化,获得重组质粒.重组pCMV-Myc-PIASxβ克隆通过酶切和测序鉴定其正确性.EcDR Ⅰ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASxβ为一条大小5 641 bp的条带;Xba Ⅰ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASXβ为2条大小分别为3 291和2 349 bp的条带,符合预计大小.Western blotting检测证实,在相对分子质量68 000处(PIASxβ融合蛋白)有特异的蛋白表达条带,与重组质粒相符.结论:成功构建了pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒,为深入研究PIAS家族的功能奠定良好的基础.
关键词： PIASxβ pCMV-Myc载体 重组质粒 基因表达 -
PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建
目的:构建PIAS3(活化型STAT3抑制蛋白)的Myc融合蛋白真核表达重组质粒,并表达融合蛋白Mye-PIAS3.方法:采用PCR方法,扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列.将该1 851 bp的特异性片段连接到T载体上,将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的Sal Ⅰ和Not Ⅰ位点之间.将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞,利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达.结果;重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性.EcoR 1酶切鉴定时有4 357和1 318 bp2条带,Xba Ⅰ酶切鉴定时有3 291 bp和2 384 bp 2条带,与预期结果一致.测序结果显示,13个氨基酸Myc在N端,然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列.pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞,利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达,在相对分子质量68 000处检测到特异的蛋白表达条带.结论:成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒,并表达融合蛋白Myc-PIAS3.
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基因治疗用pUC118-ski质粒DNA纯化工艺的建立及其质量控制
目的 建立基因治疗用pUC 118-ski质粒DNA的纯化工艺,并进行质量鉴定.方法 采用碱裂解法粗提质粒,PEG/MgCl2沉淀法初步纯化后,依次通过Sepharose 6 FF分子筛层析、PlasmidSelect Xtra亲和层析和SOURCE30Q离子交换层析纯化质粒DNA.纯化的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋质粒的比例;紫外分光光度计测定质粒的A260和A280值,以A260/A280比值评价其纯度;CCK-8法检测质粒促原代培养的大鼠皮肤成纤维细胞的增殖活性;BCA法和鲎试剂凝胶法分别检测质粒DNA中残留的蛋白质和内毒素含量;PCR法检测质粒中细菌基因组DNA的含量.结果 经Sepharose 6 FF分子筛层析可有效去除质粒DNA中的RNA,经PlasmidSelect Xtra亲和层析能将超螺旋质粒DNA(scDNA)与开环质粒DNA(ocDNA)有效分离,经SOURCE30Q离子交换层析获得的质粒DNA纯度很高,但出现了少量ocDNA.获得的质粒DNA纯品中超螺旋质粒所占比例大于90.5％;纯度(A260/A280)为1.83;促原代培养的大鼠成纤维细胞的增殖活性与空载体组相比提高了22.9％ (P＜0.05),与纯化前的质粒促细胞增殖活性一致;内毒素含量小于50 Eu/mg;几乎检测不到蛋白质残留;细菌基因组DNA残留量小于1.2μg/mg.结论 建立了基因治疗用pUC 118-ski质粒DNA的纯化工艺,纯化产品的质量指标均符合国家食品药品监督管理局(SFDA)的标准,为申请该基因药物的临床试验及大规模制备质粒DNA奠定了基础.
