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人纤溶酶真核表达重组质粒的构建
目的:构建人纤溶酶真核表达载体以用于抗栓、溶栓的研究.方法:人胎肝组织经PCR技术扩增人纤溶酶基因,定向克隆至真核表达质粒pC-DNA-3后测序.经测序鉴定正确后构建人纤溶酶真核表达重组质粒,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒的正确性.结果:目的基因PCR扩增产物为1740 bp,测序结果显示,目的基因PCR扩增产物与GenBank登记的序列完全相同.PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的人纤溶酶基因全长序列.结论:成功构建了含有人纤溶酶基因的真核表达重组质粒,并进行了鉴定.
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人纤溶酶活性动态显色检测方法的建立及验证
目的 建立人纤溶酶(plasmin,Plm)活性的动态显色检测方法,并进行验证.方法 用微量滴定板作为载体,将不同活性浓度的Plm(1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 IU/ml)分别与不同浓度的发色底物S-2251(2.0、1.0、0.66、0.33 mg/ml)混匀,连续监测10 min,测定反应体系吸光值变化率(△A/min),确定方法的反应参数.同时对方法的选择性、线性范围、定量下限、准确度、精密性、特异性及稳定性进行验证.采用建立的方法检测Plm纯化样品.结果 确定定量上限为0.6 IU/ml,底物浓度为0.66 mg/ml;监测5 min时校正标样及质控样品回收率为92.0％～111.8％,定量下限样品回收率为96.5％～118.0％.注射用水、稀释液、尿激酶(Urokinase,UK)、6-氨基己酸(6-Aminocaproic acid,EACA)、人纤溶酶原(plasminogen,Plg)等组分的响应低于定量下限响应的8.22％,并低于内标响应的0.86％,表明该方法具有良好的选择性;线性范围为0.05～0.6IU/ml,校正标样回收率在96.8％ ～111.2％之间,R2≥0.99;定量下限为0.05 IU/ml,定量下限处准确度在115.2％～ 116.2％之间,CV≤5.0％;高、中、低浓度质控样品检测结果准确度在102.3％～ 111.8％之间;批内CV值≤7.7％,批间CV值≤5.2％;0.5 μg/mlUK对Plm活性检测无影响,EACA浓度在0.05 ～0.2 mol/L之间及Plg浓度低于0.3 mg/ml时对Plm活性检测结果无影响;Plm质控样品复溶后在室温及2～8℃放置1h不影响检测结果.Plm纯化样品活性回收率为91.84％.结论 本方法具有良好的准确度、精密度、特异性及稳定性,可用于工艺样品中Plm活性的检测.
