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锌、铁、锰饱和乳铁蛋白体外抑制乙型肝炎病毒DNA的研究
目的 探讨锌、铁、锰饱和乳铁蛋白体外抑制乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)作用.方法 以天然HBV感染HeDG2细胞为模型,通过应用荧光定量PCR法测定细胞中HBV-DNA水平来检测锌、铁、锰饱和乳铁蛋白抑制HBV效果,并应用四甲基偶氛唑盐比色法(MTT)进行锌、铁、锰饱和乳铁蛋白对HepG2细胞的毒性研究.结果 锌、铁、锰饱和乳铁蛋白对细胞的大无毒剂量(TD0)分别为1.5、3.0和1.5g/L;用HBV感染HepG2细胞,分别加入锌、铁、锰饱和乳铁蛋白,各实验组对HBV-DNA均有显著抑制作用,浓度为1.5g/L的锌、铁、锰饱和乳铁蛋白抗HBV-DNA结果经对数转换后分别为:(5.746±0.114)、(6.446±0.103)和(5.999±0.725).结论 当HepG2细胞感染乙肝病毒后,锌、铁、锰饱和乳铁蛋白可以显著抑制HBV-DNA,抑制作用强弱依次为:锌饱和乳铁蛋白＞锰饱和乳铁蛋白＞铁饱和乳铁蛋白.
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牛源乳铁蛋白体外抗HBsAg分泌的研究
目的 探讨牛源乳铁蛋白(BLF)体外抑制HbsAg分泌作用.方法 以天然HBV感染HepG2细胞为模型,应用ELISA法测定细胞上清中的HBsAg水平,并用MTT法对BLF对HepG2细胞的毒性进行研究.结果 BLF对细胞的大无毒荆量(TD0)为3.Og/L,半数中毒剂量(TD50)为11.08g/L;先用HBV对HepG2细胞进行感染,再加入BLF,各浓度组BLF均对HBsAg分泌有一定抑制作用,BLF浓度3.0g/L时对HBsAg的抑制率达58.34%;将BLF与HBV阳性血清作用后再接种于细胞,各实验组均不能抑制HBsAg分泌,将BLF先与细胞作用后洗去BLF,在接种病毒后,BLF浓度0.5g/L以上各组均能显著抑制HBsAg分泌,但BLF0.1g/L组不能抑制HBsAg分泌.乳铁蛋白水解物不能抑制HBsAg分泌.结论 牛源乳铁蛋白不能通过与HBV结合来阻断对HepG2细胞的感染,但可以通过对HepG2细胞的保护来阻断感染;当HepG2细胞感染HBV后,牛源乳铁蛋白仍可抑制HBsAg分泌,将乳铁蛋白水解后无抑制作用,说明是乳铁蛋特有结构起作用.
关键词： 牛源乳铁蛋白 乙型肝炎病毒表面抗原 HepG2细胞系 -
高迁移率族蛋白1促进原发性肝癌细胞增殖
目的 探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)及晚期糖基化终产物受体(RAGE)在原发性肝癌中的表达,研究HMGB1促进肝癌细胞增殖的作用以及相关的分子机制.方法 取肝癌组织及癌旁组织各25例,免疫组化法观察组织样本中HMGB1及RAGE的表达;体外培养肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞系L02,用Western blot检测细胞系中HMGB1及RAGE的表达.向HepG2肝癌细胞系中加入外源性重组人HMGB1蛋白(rhHMGB1),用MTT法检测处于不同浓度rhHMGB1(0、10、50和100μg/L)以及不同处理时间(0、12、24和36 h)作用下HepG2细胞的增殖率;用Western blot检测细胞中RAGE和NF-κB的表达.结果 HMGB1和RAGE蛋白在肝癌组织的阳性表达率为64％和72％,分别高于癌旁组织的20％和28％(P<0.05).随着细胞培养时间的延长,HMGB1及RAGE的表达呈上升趋势;随着rhHMGB1浓度的升高或处理时间的延长,HepG2细胞的增殖率显著提高(P<0.05),细胞中RAGE和NF-κB的表达显著上调(P<0.05).结论 HMGB1和RAGE蛋白在肝癌组织及肝癌细胞中高表达.HMGB1可能通过与其受体RAGE结合,进一步激活NF-κB信号通路,从而促进肝癌细胞增殖.
关键词： 原发性肝癌 高迁移率族蛋白1 晚期糖基化终产物受体 HepG2细胞系 细胞增殖 -
FH535抑制人肝癌细胞HepG2增殖及cyclin D表达
目的 探讨β-catenin抑制剂FH535对人肝癌细胞系HepG2增殖的影响及可能机制.方法 HepG2细胞分为对照组和FH535用药组,使用改良3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐比色法(MTS)检测FH535对HepG2细胞增殖的影响,以Western blot法检测HepG2细胞β-catenin以及cyclin D蛋白表达水平,用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测HepG2细胞cyclin D mRNA水平.结果 FH535能够显著抑制HepG2细胞的增殖,呈时间和剂量依赖性.与对照组相比,FH535给药组HepG2细胞内β-catenin蛋白表达无差异.FH535给药组细胞wnt/β-catenin信号通路的靶基因cyclin D的mRNA和蛋白的表达显著下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.0001).结论 FH535通过抑制cyclin D mRNA及cyclin D蛋白表达而抑制HepG2细胞增殖.
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人肝癌细胞系HepG2在遗传毒物检测中的应用及其进展
外来化合物的体外遗传毒性实验常用于各种致癌物和致突变物的快速筛选.HepG2是一种分化好的人肝胚细胞瘤细胞系,保留了较完整的代谢酶及其活性.以HepG2细胞作为实验系统检测各种致癌及非致癌物,在多个观察终点均获得相应的阳性及阴性结果.
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hTERT siRNA对HepG2细胞hTERT表达及端粒酶活性的影响
目的 研究siRNA技术对肝癌HepG2细胞系hTERT mRNA表达及端粒酶的抑制作用,探讨siRNA抑制肿瘤细胞的作用及机理.方法 体外转录合成hTERT siRNA并转染入HepG2细胞株中,应用RT-PCR观察HepG2细胞中hTERT mRNA表达改变,Western blot检测hTERT蛋白的表达,应用末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定转染24h、48h后细胞端粒酶活性.结果 hTERT siRNA转染后,对HepG2细胞hTERT mRNA和蛋白表达明显抑制.转染后24h端粒酶活性转染组均数为(0.167±0.019),与未转染组均数(0.823±0.027)、空质粒阴性对照组均数(0.826±0.031)比较,差异有统计学意义(P<0.05);48h端粒酶活性转染组均数为(0.153±0.017),与未转染组均数(0.816±0.022)、空质粒阴性对照组均数(0.809±0.028)比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 靶向hTERT的siRNA,能有效抑制肝癌细胞系HepG2 hTERT-mR-NA和蛋白表达及端粒酶活性.
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AMPKγ基因沉默对AMPK活化及调血脂作用的影响
构建针对AMPKγ基因的siRNA慢病毒载体,检测其介导的RNA干扰对人肝癌细胞株HepG2中AMPKγ基因表达的沉默作用,并考察AMPKγ基因沉默对天然AMPK激动剂虫草素激活AMPK和调节脂质合成的影响.设计并合成了特异针对AMPKγ基因的shRNA Oligo片段,经退火、酶切、连接将目的片段插入到慢病毒干扰载体中,经感受态细胞转化、PCR鉴定挑选阳性克隆测序后,与包装质粒和包膜质粒共转染至293T细胞包装病毒,收集浓缩病毒进行滴度测定.通过荧光观察和Western blotting筛选可有效沉默AMPKγ基因的慢病毒株.在AMPKγ基因稳定沉默细胞株中,利用Westem blotting考察AMPKγ基因沉默对虫草素促AMPK磷酸化活性的影响,油红O染色观察虫草素对细胞内脂质堆积情况的影响,并用试剂盒测定细胞内TC、TG含量.结果表明,成功构建了4种特异针对AMPKγ基因的慢病毒干扰载体(GR084、GR085、GR086、GR087),Western blotting检测结果显示重组慢病毒株GR085的基因沉默效率高；给予虫草素并不会影响AMPKγ蛋白的表达,但能够显著上调正常细胞内AMPK蛋白的磷酸化水平.利用慢病毒稳定沉默AMPKγ基因的表达后,虫草素促AMPK磷酸化作用和下调脂质合成作用被显著抑制.研究表明,AMPKγ亚基可能与虫草素活化AMPK和调节脂质合成作用相关.
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TNF-α影响肝癌HepG2细胞表达B7-H1分子的研究
目的 研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人肝癌细胞B7-H1分子表达的影响.方法 人肝癌HepG2细胞体外培养,经过不同浓度的TNF-α干预后,采用FCM检测细胞凋亡,RT-PCR检测B7-H1 mRNA的表达.结果 不同浓度的TNF-α能促进HepG2细胞凋亡;干预后HepG2细胞的B7-H1基因表达明显增加.结论 TNF-α能促进HcpG2细胞凋亡,并且上调HepG2细胞B7-H1基因的表达.
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p100蛋白慢病毒干扰载体及p100沉默的HepG2稳定细胞系的构建
目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系.方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建p LKO.3G-p1001慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定.将构建好的p100 shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒.运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系.荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果.结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株.慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90％以上细胞发出绿色荧光,Western blot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低.结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系.
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MMP2,MMP9在肝细胞癌中表达的比较研究
目的分析MMP2和MMP9在肝细胞癌中的表达,探讨不同的基质金属蛋白酶(MMPs)与肝细胞癌侵袭转移的特异相关性.方法免疫细胞化学检测HepG2细胞系中MMP2和MMP9的表达,免疫组织化学检测38例HCC肝癌组织中MMP2和MMP9的表达.结果MMP9在HepG2细胞系的表达高于MMP2的表达.在HCC组织中MMP9的表达率84.2%(32/38)明显高于MMP2的表达52.6%(20/38),二者有显著差异(P<0.05).结论MMP9在体内外的表达均高于MMP2,推测可能MMP9与HCC的侵袭转移关系更为密切.
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肝癌多药耐药细胞系HepG2/ADM的建立及耐药机制研究
目的建立人肝癌多药耐药细胞系并研究其耐药特性及机制.方法应用人肝癌细胞株HepG2,采用阿霉素(ADM)浓度梯度递增诱导法,建立多药耐药细胞系HepG2/ADM.相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多药耐药基因(mdr)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH/GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平.结果HepG2/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对阿霉素的耐药性提高了89.38倍.流式细胞仪分析发现(45.5±5.1)%的HepG2/ADM细胞表面P-gp表达阳性,而对照细胞HepG2表达仅为(11.3±1.2)%,二者差异有显著性(P＜0.01);HepG2/ADM和HepG2细胞的MRP及GSH/GST表达无明显变化(P＞0.05).RT-PCR检测发现HepG2/ADM中MDR mRNA高表达.结论HepG2/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因MDR mRNA表达升高.
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MMP2和MMP9在HepG2肝癌细胞系及HCC组织中表达的比较研究
目的 分析MMP2和MMP9在HepG2细胞系及肝细胞癌(HCC)组织中的表达,探讨不同的基质金属蛋白酶(MMPs)与肝细胞癌侵袭转移的特异相关性.方法 免疫细胞化学检测HepG2细胞系中MMP2和MMP9的表达,免疫组织化学检测38例HCC肝癌组织中MMP2和MMP9的表达.结果 MMP9在HepG2细胞系的表达高于MMP2的表达.MMP9和MMP2在HCC组织中均有所表达,但MMP9的表达率84.2%(32/38)明显高于MMP2的表达52.6%(20/38),二者有显著差异(P<0.05).结论 MMP2、MMP9的表达在体内外呈现出一致性,即MMP9在体内外的表达均高于MMP2,推测可能MMP9与HCC的侵袭转移关系更为密切.
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齐墩果酸和绿原酸对HepG2细胞及P450酶的影响
目的 观察齐墩果酸和绿原酸对HepG2细胞增殖、周期变化及CYP相关基因表达的影响.方法 以利福平为对照,采用四甲基偶氮唑盐(MTr)比色法、流式细胞术、实时定量PCR技术检测,测定不同质量浓度齐墩果酸、绿原酸的作用.结果 齐墩果酸、绿原酸对HepG2细胞增殖有明显抑制作用,阻滞HepG2细胞停留于S期.齐墩果酸和利福平均能诱导CYP1A1和CYP3A4表达.绿原酸抑制CYP1A1和CYP3A4表达.结论 齐墩果酸、绿原酸均能影响细胞周期来抑制HepG2细胞生长,并显示不同质量浓度对CYP1A1、CYP3A4 mRNA的表达影响不一致.
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RNA干扰下调KMT2C基因表达对肝癌细胞HepG2增殖的影响及其机制
目的 探讨组蛋白甲基化转移酶基因KMT2C对肝癌细胞HepG2的增殖影响及其可能的机制.方法 采用shRNA基因干扰技术抑制HepG2细胞中KMT2C基因的表达,采用细胞计数、CCK-8细胞增殖实验以及平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化情况;Western blotting和qRT-PCR检测KMT2C基因干扰前后HepG2细胞中EGFR的表达情况.结果 甲基化转移酶KMT2C基因干扰成功后,HepG2细胞的增殖能力受到明显抑制(P<0.05),细胞周期阻滞在S期;同时细胞内的EGFR蛋白表达量显著下降(P<0.05).结论 干扰KMT2C基因的表达可以显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖,其作用机制可能和EGFR信号通路有关.
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PTEN-Long通过PI3K-AKT途径对HepG2肝癌细胞的影响
[目的]探讨PTEN-Long对肝细胞癌HepG2细胞的影响及其脂质磷酸酶活性与PI3K-AKT信号通路之间的关系.[方法]细胞转染法转染PTEN-Long、11EN-LongC302R和Vector于HepG2细胞.转染48h后,检测各组细胞增殖数,Western blot法检测各组细胞PTEN-Long、pAkt、pS6K表达变化,流式细胞法检测各组细胞细胞凋亡水平变化,细胞划痕法检测各组细胞迁移情况.[结果]细胞转染后,PTEN-Long组、PTEN-LongC3320R组表达PTEN-Long蛋白量无显著性差异;与Vector、PTEN-Long320R组相比,PTEN-Long组pAkt (Ser473)、pS6K (Thr389)表达量明显下降.从转染后48h开始,PTEN-Long组细胞增殖数较Vector组、PTEN-LongC320R组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05);PTEN-Long组较Vector组、PPTEN-LongC320R组凋亡明显增强(P＜0.05);划痕14h后,PTEN-Long组、PTEN-LongC320R组较Vector组的迁移细胞数明显减少(P＜0.05).[结论] PTEN-Iong依赖于其脂质磷酸酶活性,通过PI3K-AKT通路调控肝癌HepG2细胞的增殖与凋亡.
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GFP/HBxn、 GFP/HBxc融合蛋白重组载体的构建和稳定表达细胞系的建立
目的 分别构建绿色荧光蛋白(GFP)与氨基端或羧基端缺失突变乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的重组表达载体,建立稳定表达GFP/HBxn、GFP/HBxc融合蛋白的HepG2细胞系,以进一步研究HBx缺失突变对其生物功能的影响.方法 PCR法分别扩增氨基端缺失50aa的HBx及羧基端缺失50aa的HBx基因,用HindⅢ和KpnⅠ双酶切定向插入pEGFP-C1相应酶切位点并转化宿主菌DH5α,双酶切鉴定pGFP/HBxn、pGFP/HBxc;脂质体转染法转染HepG2细胞,G418筛选出抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP的表达,挑选抗性克隆细胞扩大培养并传代.RT-PCR法、Western blot法检测转染细胞HBxn、HBxc基因、蛋白的表达.结果 扩增的HBxn、Hbxc基因片段琼脂糖凝胶电泳显示符合预估大小.重组质粒pGFP/HBxn、pGFP/HBxc经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后电泳,符合预估大小;转染pGFP/HBxn及pGFP/H Bxc的HepG2细胞可见抗性细胞克隆形成,并可见阳性克隆细胞均有GFP表达.RT-PCR与Western blot法检测到HBxn、HBxc的表达.结论 成功构建了GFP/HBxn、GFP/H Bxc真核重组表达载体pGFP/HBXn、pGFP/HBxc,获得了稳定表达GFP/HBxn、GFP/H Bxc融合蛋白的HepG2细胞系,为进一步研究HBx缺失突变对其生物功能的影响奠定了基础.
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微小RNA miR-199a/a*模拟物转染肝癌细胞HepG2中Met原癌基因的表达
目的 探讨在肝癌细胞系HepG2中,Met是否为miR-199a/a+的靶基因.方法 将miR.199a/a+的模拟物及阴性对照物分别转染至HepG2细胞中,转染后48 h及72 h分别提取RNA及蛋白行RT-PCR及Western Blot检测Met的表达.结果与阴性对照相比,转染Up-miR-199a+组的Met mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.001)表达水平均显著下调;而Up-miR-199a组与阴性对照组相比无统计学差异.结论 肝癌细胞HepG2中miR-199a+负调控Met的mRNA及蛋白表达.
关键词： 微小RNA miR-199a/a* Met 肝癌 HepG2细胞系 -
HIF1α和HIF2α调控低氧诱导的MCF-7和HepG2细胞PAI-1表达
目的 研究低氧下HIF1α和HIF2α在MCF-7和HepG2细胞中调控表达PAI-1的作用机制.方法 低氧和常氧处理人肝癌细胞HepG2和人乳腺癌细胞MCF-7,用小干扰RNA(siRNA)敲低HIF1α和HIF2α,用实时定量PCR测定PAI-1 mRNA,ELISA和免疫印迹等方法检测PAI-1含量、HIF1α和HIF2α蛋白表达.结果 在HepG2和MCF-7两种细胞系中,PAI-1 mRNA在低氧下表达量明显升高,而且PAI-1蛋白也明显升高.低氧下用siRNA分别敲低HIF1α和HIF2α,在MCF-7细胞系中敲低HIF1α降低了PAI-1的mRNA水平及其含量,在HepG2细胞系中敲低HIF2α降低了PAI-1的mRNA水平及其含量.结论 HIF1α和HIF2α分别调控MCF7和HepG2细胞中低氧诱导的PAI-1表达,提示在肝癌和乳腺癌中PAI-1的表达升高的调控机制可能是不同的.
关键词： 低氧诱导因子 纤溶酶原激活物抑制剂 HepG2细胞系 人乳腺癌细胞系 -
戊型肝炎病毒感染HepG2细胞蛋白质组学研究
比较人肝癌细胞系HepG2细胞感染和未感染HEV后细胞内蛋白质表达谱的变化,为初步探索HEV在宿主细胞内感染机制及致病机理奠定基础。方法 RT-nPCR和免疫荧光确认HEV感染HepG2细胞后,利用同位素标记相对和绝对定量( isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术比较HEV感染组与未感染组HepG2细胞蛋白质表达差异。结果 HEV感染导致328种蛋白发生变化,与未感染组相比,262种蛋白表达上调,66种蛋白表达下调。结论 HEV感染HepG2细胞导致大量蛋白差异表达,功能预测表明这些蛋白涉及到宿主的物质代谢、细胞信号转导、免疫蛋白、细胞骨架成分等方面,为今后研究HEV感染机制和致病机理奠定基础。
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肝癌细胞受照后代生长特性及放射敏感性变化
目的:探讨肝癌细胞照射后存活后代生长特性及放射敏感性的变化.方法:人肝癌细胞株HepG2和其照射后存活后代体外培养,测定其群体倍增时间、放射敏感性.结果:HepG2的群体倍增时间(96.0±6.8)h,克隆形成率为(13.0±1.5)%,SF2为0.41±0.05.HepG2照射后存活后代群体倍增时间为(12.48±12.2)h(t=3.572,P＜0.05),克隆形成率为(5.0±0.6)%(t=8.537,P＜0.01),SF2为0.65±0.08(t=3.811,P＜0.05).结论:肝癌细胞照射后存活后代生长延缓,放射敏感性降低.
