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胸水高迁移率族蛋白B1测定的临床意义研究
目的 探讨胸水高迁移率族蛋白B1 水平检测对胸水性质鉴别的临床意义.方法 采用酶联免疫吸附试验对26 份漏出液、37 份炎症性渗出液和42 份肿瘤性渗出液胸水标本进行HMGB1 检测,并与白细胞计数作相关性分析.结果 炎症性渗出液和肿瘤性渗出液的HMGB1 水平均显著高于漏出液(P<0.01),而炎症性渗出液的HMGB1 水平明显高于肿瘤性渗出液(P<0.01);胸水HMGB1 对渗出液鉴别的灵敏度为89% 时,其特异性为84%;渗出液中HMGB1 水平与白细胞计数间具有正相关性(r=0.487,P<0.01).结论 胸水HMGB1 检测对于胸水性质的鉴别具有较好的临床意义.
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高迁移率族蛋白B1及其受体在炎症发生中的作用机制研究
高迁移率族蛋白(high mobility group protein,HMG)是一大类富含电荷的低分子非组蛋白染色体核蛋白,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移能力而得名,HMGBI属于HMG家族成员之一,广泛存在于各种细胞中,人HMGB1基因定位于染色体13q12,在进化过程中高度保守,含215个氨基酸残基,N端富含赖氨酸,酸性尾端富含天冬氨酸和谷氨酸,2个"L"型HMG box,分别是A box(1～85个残基)和丑box(88～162个残基),是结合DNA的功能结构域,与酸性尾端共同组成3个功能区.
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间充质干细胞对肺移植缺血再灌注损伤大鼠高迁移率族蛋白B1表达的影响
目的 建立大鼠肺移植缺血再灌注损伤模型,静脉注射骨髓间充质干细胞(MSCs),比较血清及肺组织中晚期炎症介质高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)在mRNA及蛋白水平的变化.方法健康雄性8～10周SD大鼠40只,分为4组每组10只,包括假手术组、肺移植缺血再灌注组、生理盐水对照组和MSCs治疗组.除假手术组大鼠仅行开胸不进行肺移植手术外,其他组大鼠在麻醉下行左侧单肺移植,肺移植后开放肺静脉形成再灌注.缺血再灌注组不做任何处理;MSCs治疗组尾静脉注射MSCs悬液1 ml(1.0×107个/ml);生理盐水组鼠尾静脉注射等剂量生理盐水.四组大鼠均在缺血再灌注24 h后取血处死,取左肺组织备用.测定氧合指数、肺湿/干比值及制作HE病理切片.通过ELISA检测血清中HMGB1水平的变化,通过RT-PCR和Western印迹检测四组肺组织HMGB1表达的变化.结果 缺血再灌注24 h各组氧合指数分别为383 ±15、174 ±24、170 ±30、217 ±21,肺移植缺血再灌注组及生理盐水明显低于假手术组(均P＜0.01),注射MSCs后氧合指数高于缺血再灌注组(P＜0.01).HE染色病理结果提示缺血再灌注组大鼠比假手术组肺泡间隔增厚,肺泡内出现渗出液,并见少量炎症细胞,提示肺损伤;注射MSCs后肺泡水肿液体减少,肺泡间隔增厚减轻,炎症细胞浸润减少;生理盐水组病理表现同缺血再灌注组.四组湿/干比分别为4.16 ±0.12、5.38 ±0.19、5.24 ±0.15和4.47 ±0.14,缺血再灌注组大鼠高于假手术组(P＜0.05),注射MSCs后湿/干比低于缺血再灌注组(P＜0.05).ELISA结果显示缺血再灌注组[(287 ±37)ng/ml]、生理盐水组[(260 ± 24)ng/ml]和MSCs治疗组[(101 ±14)ng/ml],血清中HMGB1 水平显著高于假手术组[(41 ±5)ng/ml],均P＜0.01.其中MSCs治疗组HMGB1水平显著低于缺血再灌注组和生理盐水组(均P＜0.01).缺血再灌注组血清HMGB1水平与氧合指数(r=0.759,P＜0.05)和湿/干比呈正相关(r=0.725,P＜0.05).RT-PCR结果显示HMGB1 mRNA水平在假手术组低,缺血再灌注组明显提高,经过MSCs治疗后显著降低.Western印迹在蛋白水平检测结果与mRNA水平结果一致.结论 肺移植手术可以引起肺组织中HMGB1水平的增高,而输入MSCs治疗后肺组织HMGB1水平有显著的降低.MSCs有可能在肺移植中对移植肺发挥保护作用.
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首发精神分裂症患者血清中高迁移率族蛋白B1及细胞因子的变化分析
目的 观察首发精神分裂症患者抗精神病药治疗前后血清中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1 β)、白细胞介素-6(IL-6)的变化及其相互关系,探索HMGB1在精神分裂症免疫机制中的作用.方法 收集郑州大学第一附属医院2013年1月至2014年12月住院治疗的首发未用药精神分裂症患者30例和30名健康对照者.酶联免疫法(ELISA)测定用药前后血清IL-1β、IL-6、TNF-αHMGB1水平,以阳性和阴性症状量表(PANSS量表)评定患者用药前后的精神症状.结果 (1)首发精神分裂症患者血清HMGB1[(80±13) μg/L]、IL-1β[(51 ±6) ng/L]、IL-6[(44±18) ng/L]、TNF-α水平[(59±10) ng/L]均高于健康对照组[(54±13)μg/L,(25 ±19、17 ±8、41±16) ng/L](均P＜0.05);经利培酮治疗后,患者血清中上述因子水平均低于治疗前,且差异均有统计学意义(均P＜0.05).(2)精神分裂症患者血清HMGB1水平与IL-1β、IL-6、TNF-α水平、PANSS量表阴性症状评分均呈正相关(r=0.377、0.426、0.454、0.558,均P＜0.05).结论 精神分裂症患者存在免疫激活,HMGB1可能在精神分裂症免疫机制中发挥促炎作用,抗精神病药物治疗后HMGB1水平的下降可能为精神症状改善的一个监测指标.
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地龙对矽肺模型大鼠α-平滑肌肌动蛋白和高迁移率族蛋白B1表达的影响
目的 观察地龙对矽肺模型大鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达的影响.方法 45只大鼠随机分为空白组、模型组和地龙干预组.建立大鼠矽肺模型,地龙干预组用地龙煎液4 ml/kg灌胃,空白组和模型组用等量生理盐水灌胃.每组在第7、14、28天处死5只大鼠.将肺组织行HE染色及天狼星红染色,用RT-PCR、Western blot法检测α-SMA和HMGB1mRNA和蛋白的表达.结果 与空白组比较,模型组大鼠肺组织中α-SMA和HMGB1 mRNA及蛋白表达水平第7、14、28天时上调,差异有统计学意义(P＜0.01),与模型组比较,地龙干预组大鼠肺组织中α-SMA和HMGB1mRNA及蛋白表达水平在第7、14、28天时下调,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论 地龙抑制矽肺胶原沉积,肺纤维化形成,可能与抑制肺组织HMGB1表达及α-SMA的活化相关.
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一氧化碳中毒后迟发性脑病血清高迁移率族蛋白B1水平及临床意义
目的 探讨急性一氧化碳(CO)中毒后迟发性脑病患者血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)水平的变化及其临床意义.方法 CO中毒后迟发性脑病病例组34例、CO中毒组32例、对照组32例,采用酶联免疫吸附法(EHSA)检测血清HMGB1的水平,采用日常生活能力量表(ADL)、常识-记忆-注意测验(IMCT)、长谷川痴呆量表(HDS)比较血清HMGB1的水平变化及与量表评分的关系.结果 CO中毒后迟发性脑病组急性期血清HMGB1水平明显高于CO中毒组和对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).CO中毒后迟发性脑病病例组恢复期血清HMGB1水平明显低于急性期,差异有统计学意义(P＜0.05);与恢复期比较,迟发性脑病病例组急性期ADL评分升高,HDS、IMCT评分降低,差异均有统计学意义(P＜0.01).迟发性脑病病例组急性期、恢复期血清HMGB1水平与HDS和ADL评分呈正相关(相关系数分别为0.612、0.607、0.609、0.612,P＜0.01).结论 HMGB1作为重要的晚期炎性介质参与了迟发性脑病病例组的炎症反应过程,且与HDS和ADL评分呈正相关,可作为急性一氧化碳中毒患者病情的主要监测指标之一.
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当归与激素合用对哮喘小鼠的治疗作用及其机制
目的:探讨当归与激素合用对哮喘小鼠的治疗作用及其机制.方法:取BALB/c小鼠随机分为对照组、血瘀模型组、哮喘模型组、氢化可的松组、当归组、氢化可的松与当归合用组(n=12).采用卵白蛋白致敏、激发,复制哮喘模型;使用氢化可的松复制血瘀模型.观测当归、氢化可的松及其合用对小鼠血液流变学(全血黏度与血清TXB2含量)和哮喘(哮喘行为学、肺功能、肺指数与肺组织含水量)的影响,采用ELISA法、免疫组化法测定相关细胞因子和HMGB1/TLR4/NF-KB蛋白质的表达水平.结果:8 g/kg当归、0.05 g/kg氢化可的松及其合用可明显缓解哮喘行为学指标,提高肺功能,降低肺指数及肺组织含水量,降低BALF中TNF-α、IL-Iβ及IL-6水平,抑制肺组织HMGB1、TLR4及NF-KB蛋白质的高表达;当归与氢化可的松合用对提高哮喘小鼠肺功能、降低相关细胞因子(TNF-α、IL-1β及IL-6)水平明显优于单独使用当归组,抑制肺组织中TLR4和NF-κB蛋白质表达的作用优于单独使用当归或氢化可的松.二者合用后可缓解氢化可的松所致的小鼠血清TXB2含量升高、血液粘稠度增加.结论:当归与激素及其合用具有明显的平喘作用,抑制HMGB1/TLR4/NF-κB蛋白质合成是其平喘的机制之一.当归与激素合用改善肺功能的作用更强,可能与加强抑制TLR4/NF-KB合成有关.合用当归可缓解激素在治疗哮喘时引起的血液流变学异常变化.
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高迁移率族蛋白B1对人T淋巴细胞免疫功能影响的体外研究
目的 观察高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对健康人T淋巴细胞增殖的影响,并对其机制进行初步探讨.方法 分离健康人外周血单个核细胞(PBMCs),调整细胞浓度后接种于细胞培养板并加入重组人高迁移率族蛋白B1(rhHMGB1)进行刺激.以四甲基偶氮唑盐微量Ⅱ酶反应比色法(MTT)检测细胞数量和细胞活性,观察HMGB1对T淋巴细胞增殖活性的影响.采用四色流式细胞术(FCM)分析CD3+淋巴细胞CD4表达.细胞中白细胞介素-2(IL-2)、IL-2α受体(IL-2Rα)基因表达水平采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析. 结果①500～1000 μg/L rhHMGB1作用48 h后T淋巴细胞增殖反应显著抑制,低于这一剂量对其增殖活性影响不显著.②不同rhHMGB1刺激时间和作用剂量对CD4+ T淋巴细胞未造成明显改变,但rhHMGB1能时间-剂量依赖性增加Th2亚群比例,并因此降低Th1/Th2比值,刺激后T淋巴细胞免疫功能出现Th1优势向Th2优势偏移.③经植物血凝素激活后12 h T淋巴细胞IL-2和IL-2Rα基因表达达到峰值;rhHMGB1与T淋巴细胞共同培养12 h后,10～100 μg/L剂量可明显上调IL-2和IL-2Rα基因表达;而较高剂量rhHMGB1(100～1 000 μg/L)刺激持续48 h上述效应衰竭,并表现出相反的变化趋势.结论 HMGB1对T淋巴细胞包括增殖、分化和细胞因子分泌等免疫功能具有直接调节效应.剂量蓄积和持续刺激可诱导T淋巴细胞功能亚群从促炎优势向抗炎优势转化.
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微小RNA-141对人单核细胞合成高迁移率族蛋白B1的调控作用
目的 探讨微小RNA-141(miR-141)对人单核细胞株THP-1高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达的调控作用.方法 体外培养THP-1细胞,化学合成人miR-141的拟似物和抑制剂.用脂质体Lipofectamine RNAi MAX转染miR-141的拟似物或抑制剂进入THP-1细胞,转染48 h后分别用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测HMGB1的mRNA和蛋白表达.结果 转染100 nmol/L miR-141拟似物后,可提高THP-1细胞miR-141的表达水平(35.33±7.24比1.21±0.20,t=-8.408,P=0.010);转染100 nmol/LmiR-141抑制剂后,可抑制THP-1细胞miR-141的表达水平(0.55±0.12比1.09±0.05,t=7.473,P=0.002).与相应对照组比较,THP-1细胞在过表达miR-141后,HMGB1的mRNA和蛋白表达明显下调(mRNA:0.43±0.06比0.97±0.08,t=9.760,P=0.001;蛋白:0.63±0.12比1.00±0.11,t=2.991,P=0.040);而抑制THP-1细胞中miR-141后,HMGB1的mRNA和蛋白表达均明显上调(mRNA:2.13±0.11比1.16±0.13,t=-9.977,P=0.001;蛋白:1.78±0.04比0.96±0.09,t=-13.778,P=0.000).结论 miR-141能调控人单核细胞HMGB1的表达水平,提示miR-141在调控免疫细胞的炎症反应过程中具有重要的作用.
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高迁移率族蛋白B1诱导巨噬细胞Janus激酶/信号转导及转录激活子通路活化的研究
目的初步探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)致炎效应的信号转导机制.方法清洁级雄性Wistar大鼠,取其腹腔巨噬细胞,培养3 d后以10 mg/L HMGB1刺激.刺激完毕后直接在培养瓶中裂解细胞,分别采用免疫沉淀、免疫印迹法和凝胶阻滞分析等技术观察不同时间点Janus激酶2(JAK2)、信号转导及转录激活子-1(STAT1)以及STAT3的活化情况.结果HMGB1可诱导大鼠腹腔巨噬细胞STAT1、STAT3在短时间内(2 h)活化,其中STAT3活化为迅速,10 min即可达到活化高峰.但HMGB1不能在短时间内(2 h)诱导JAK2活化.结论 JAK/STAT途径可能参与了HMGB1致炎效应的信号转导机制.
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HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信号通路在骨髓间充质干细胞移植治疗内毒素致凝血功能障碍大鼠中的作用
目的 探讨高迁移率族蛋白B1-晚期糖基化终末产物/Toll样受体-核转录因子-κB(HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB)信号通路在骨髓间充质干细胞(BMSC)移植治疗内毒素脂多糖(LPS)致凝血功能障碍大鼠中的作用.方法 体外分离培养4～5周龄雌性SD大鼠BMSC,取第4代细胞鉴定成功后用于后续实验.按随机数字表法将大鼠分为生理盐水(NS)对照组、LPS组和BMSC组,每组15只.经大鼠大隐静脉注射LPS 1 mg/kg构建LPS致凝血功能障碍模型;NS对照组给予等量NS.BMSC组于制模后2 h经尾静脉注射BMSC 0.5 mL(含BMSC 1×106个);NS对照组和LPS组给予等量NS.分别于术后1、3、7 d取大鼠腹主动脉血,检测凝血功能指标〔包括血小板计数(PLT)、血小板体积分布宽度(PDW)、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)、大型血小板比例(P-LCR)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、国际标准化比值(INR)及纤维蛋白原(FIB)〕;分别采用实时反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血中HMGB1、RAGE、TLR2/4及NF-κB的mRNA表达和含量.结果 ① 体外培养细胞呈梭形或扁平型生长,第4代细胞表型经流式细胞仪鉴定为BMSC.② 凝血功能指标:与NS对照组比较,LPS组1 d PLT、PCT、FIB即明显下降,PDW、MPV、P-LCP、INR即明显升高,APTT、PT、TT即明显延长;随LPS诱导时间延长,各项凝血指标均有所好转.给予BMSC干预后能明显逆转LPS诱导的凝血功能异常,1 d时各指标与LPS组比较差异即有统计学意义〔PLT(×109/L):398.8±17.9比239.1±15.8,PCT(％):0.35±0.04比0.23±0.06,FIB(g/L):1.7±0.6比0.8±0.1,PDW(％):12.4±1.6比16.2±1.5,MPV(fl):11.0±1.6比13.7±1.1,P-LCR(％):13.0±2.1比15.3±2.7,INR:1.52±0.17比1.82±0.19,APTT(s):66.3±4.1比89.5±4.5,PT(s):18.3±0.7比25.1±1.9,TT(s):87.5±7.8比115.0±9.7,均P<0.05〕,并持续至7 d.③HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信号通路相关分子:与NS对照组比较,LPS组1 d血中HMGB1、RAGE、TLR2/4及NF-κB的mRNA表达和含量即明显升高;随LPS诱导时间延长,各通路分子mRNA表达及含量逐渐下降.给予BMSC干预后,1 d时各通路分子的mRNA表达及含量即较LPS组明显降低〔HMGB1 mRNA(2-ΔΔCt):10.77±0.04比24.51±3.69,HMGB1含量(μg/L):0.48±0.01比0.95±0.06;RAGE mRNA(2-ΔΔCt):11.57±1.11比18.08±0.29,RAGE含量(μg/L):0.73±0.04比1.37±0.06;TLR2 mRNA(-ΔΔCt):2.60±0.22比12.61±0.27,TLR2含量(μg/L):0.81±0.03比1.59±0.09;TLR4 mRNA(2-ΔΔCt):2.95±0.52比4.06±0.11,TLR4含量(μg/L):0.80±0.09比1.18±0.11;NF-κB mRNA(2-ΔΔCt):1.29±0.06比7.79±0.25,NF-κB含量(μg/L):1.22±0.24比2.42±0.26;均P<0.05〕,并持续至7 d.结论 BMSC移植能够改善内毒素致凝血功能障碍大鼠的凝血功能,可能与抑制HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信号通路活化有关.
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高迁移率族蛋白B1表达水平与大鼠脓毒症严重程度及预后关系的实验研究
目的 探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)与脓毒症严重程度及预后间的关系,寻找致死性脓毒症的可靠监测及治疗指标.方法 90只SPF级雄性SD大鼠(体重250～300 g)被随机分为假手术组(A组)、盲肠结扎穿孔术(CLP)组(B组)及丙酮酸乙酯(EP)治疗组(C组),每组30只,分别施以假手术(A组)或CLP(B组和C组).术后立即腹腔注射生理盐水(NS)2 ml(A组和B组)或EP 2 ml(130 mg/kg,C组),12 h重复1次.以术后0、6、12、24、48和72 h为观察点,观察各组大鼠术后活动、进食、竖毛、腹泻、眼球凹陷、呼吸等情况;活杀并观察腹腔肠管扩张、充血、腹水、病灶包裹、肺表面充血等情况.另取20只大鼠以B、C两组同样的模型及处理方式观察生存时间.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测肝组织HMGB1 mRNA表达水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆白细胞介素-1β(IL-1β)、IL6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;绘制各组生存曲线,并进行相关分析.结果 B组大鼠术后脓毒症表现强,C组明显减轻,而A组没有相关表现或表现轻微.B组血浆IL-1β、IL6和TNF-α水平于术后6 h显著升高,至12 h已明显下降;而C组上升的幅度明显低于B组,但明显高于A组.B组肝脏HMGB1 mRNA表达水平在12 h开始升高,24 h达高峰,并维持至48 h后开始下降,且HMGB1表达水平与IL-6水平呈正相关(r=0.91).C组生存时间较B组明显延长(P＜0.01),HMGB1表达水平与脓毒症严重程度及动物生存率显著相关.结论 脓毒症晚期释放的HMGB1是脓毒症致死效应的关键炎症介质,其表达水平与实验动物的脓毒症严重程度及预后高度相关.
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辛伐他汀干预对大鼠动脉粥样硬化斑块内高迁移率族蛋白B1表达的影响
目的 观察辛伐他汀对动脉粥样硬化(AS)大鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达及斑块形态学的影响,以期揭示其抗AS的作用机制.方法 60只Wistar大鼠按随机数字表法均分为对照组、AS模型组、辛伐他汀干预组.给予高脂饮食同时灌胃维生素D3建立AS模型;干预组于第8周开始给予辛伐他汀2.5 mg·kg-1·d-1灌胃;各组分别于10周、12周用免疫组化法检测主动脉粥样硬化斑块内HMGB1蛋白表达,实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HMGB1 mRNA表达,并观察主动脉斑块形态学变化.结果 模型组主动脉斑块内HMGB1蛋白表达呈强阳性,辛伐他汀干预组HMGB1表达较模型组明显减少,12周时更为显著.与对照组比较,模型组10周、12周时HMGB1 mRNA表达均明显升高(10周:19.695±1.418、比2.981±0.753,12周:20.542±1.132比3.219±0.332,均P<0.01);辛伐他汀干预组10周、12周HMGB1mRNA表达(15.798±0.891,12.641±0.734)明显低于模型组相应时间点,且12周时表达低于10周时(P<0.05或P<0.01).模型组主动脉内有明显钙化斑块,呈环状,斑块遍及整条动脉;辛伐他汀干预后可明显抑制斑块形成,12周斑块面积较10周时进一步减小.结论 辛伐他汀能减轻AS大鼠主动脉粥样斑块形成,降低斑块组织中HMGB1的蛋白及mRNA表达,通过减轻炎症反应起到血管保护作用.
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多器官功能障碍综合征小鼠脾脏高迁移率族蛋白B1及免疫细胞功能变化的研究
目的 观察多器官功能障碍综合征(MODS)小鼠脾脏高迁移率族蛋白B1(HMGBl)与主要组织相容复合体(MHC)-II类分子I-Ab表达变化的规律,探讨HMGB1对脾脏免疫细胞功能状态的影响及其与MODS病程发展的关系.方法 选择57BL/6小鼠90只,按随机数字表法分为正常对照组,致伤后3、8、12 h及1、2、3、5和10～12 d组,每组10只.采用腹腔注射酵母多糖的方法复制小鼠MODS模型;检测小鼠脾脏HMGBl和I-A"表达水平及脾脏免疫细胞的凋亡率.结果 正常小鼠脾脏中仅有少量HMGB1 mRNA表达;在MODS病程中呈双峰升高,表现为伤后1～2 d HMGBl mRNA表达量达高峰(P＜0.01),随后表达下调,伤后5 d明显减少,但在10～12 d时表达再次升高(P＜0.05);HMGB1蛋白表达量的变化与mRNA表达变化规律基本一致.在伤后8 h脾脏单核细胞I-Ab与HMGB1蛋白表达同时升高(P＜0.01),随后两者在病程中呈反相变化.脾脏免疫细胞凋亡率在伤后呈双峰升高,与HMGB1变化规律一致.结论 MODS小鼠脾脏HMGB1表达上调与淋巴细胞凋亡密切相关,并影响脾脏抗原呈递细胞对MHC-II类分子的表达,由此削弱细胞免疫应答能力,影响MODS的病情发展.
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开腹手术中应用血必净注射液对围手术期炎症反应和器官功能的保护作用研究
目的 探讨血必净注射液对开腹手术患者围手术期炎症反应的抑制和对器官功能的保护作用.方法 采用单肓、随机、平行对照研究方法,纳入浙江大学医学院附属第一医院年龄18 ～ 80岁、美国麻醉医师协会(ASA)病情评估分级Ⅰ～Ⅲ级、欲行择期开腹手术的患者60例,按随机数字列表法将患者分为对照组(30例)和治疗组(30例),分别在麻醉诱导后以2 mL/min的速度持续输注0.9％生理盐水200 mL或血必净注射液2 mL/kg+ 0.9％生理盐水100 mL.所有患者均于麻醉诱导前(T1)、术毕(T2)、术后12 h(T3)或术后3d凌晨5点(T4)取血,测定体温、血常规、C-反应蛋白(CRP)、肝肾功能、空腹血糖(Glu)以及血清白细胞介素-6(IL-6)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)水平,同时记录不良反应发生情况评价血必净的安全性.结果 治疗组T3时体温、T3与T1体温差值均较对照组明显降低(℃:36.70 ±0.37比37.38±0.47,t=6.199,P=0.000;0.07±0.50比0.85±0.58,t=5.598,P=0.000).两组患者术后白细胞计数、中性粒细胞比例、CRP均较术前明显升高,但两组间比较差异无统计学意义.与对照组比较,治疗组患者T3时丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)明显降低[ALT (U/L):17.56±9.80比88.60±179.76,AST(U/L):27.53±13.12比84.16±151.14,TBil(μmol/L):15.46±9.79比25.63±25.33,均P＜0.05];而两组结合胆红素(CB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、Glu差异无统计学意义.两组术后IL-6均呈升高趋势,其中治疗组T2时IL-6水平(ng/L)明显低于对照组(41.42±59.74比124.84±119.66,t=3.405,P=0.001).两组T4时HMGB1水平均较T1时下降,仅治疗组下降差异有统计学意义(μg/L:22.03±15.73比45.09±33.79,P＜0.05);组间差异不明显.试验期间无严重不良反应事件发生.结论 开腹手术麻醉中应用血必净注射液能显著减轻围手术期炎症反应,对肝功能起到明显的保护作用,有利于恢复器官功能,改善预后,且安全有效.
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JAK/STAT通路介导脓毒症大鼠肝组织高迁移率族蛋白B1 mRNA表达的研究
目的:探讨Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)通路对盲肠结扎穿孔术(CLP)所致脓毒症大鼠肝组织高迁移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA表达和急性肝损害的影响.方法:采用CLP模型,大鼠随机分为正常对照组、CLP脓毒症组、JAK2激酶抑制剂AG490和STAT抑制剂雷帕霉素(RPM)处理组.采用逆转录多聚酶链式反应测定肝HMGB1 mRNA,全自动生化分析仪测定肝功能指标.结果:与正常对照组相比,CLP后6～48 h HMGB1 mRNA表达显著升高(P<0.01);血清天冬氨酸转氨酶(AST)在6～48 h增高明显(P<0.05),丙氨酸转氨酶(ALT)、 AST在24 h升高非常显著(P<0.01).与CLP组相比,AG490预处理组24 h HMGB1 mRNA和ALT水平显著下降(P均<0.01),24 h和48 h AST亦明显降低(P均<0.01);同样,RPM干预后HMGB1 mRNA表达在6 h和24 h显著抑制(P<0.05和P<0.01),ALT、AST在24 h和48 h均不同程度下降(P<0.01和P<0.05).结论:抑制JAK/STAT通路活化可明显下调肝组织HMGB1 mRNA表达,并有助于减轻CLP所致急性肝损伤.
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高迁移率族蛋白B1对人脐静脉内皮细胞增殖及迁移能力的影响
目的 探讨高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移能力的影响.方法 通过稳定转染的方法将pRNA-u6.1/Neo-对照和pRNA-u6.1/Neo-HMGB1短发夹RNA(shRNA)质粒转至HUVEC细胞,构建对照及HMGB1 shRNA细胞株,通过蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)和实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行稳定转染细胞的鉴定,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞株增殖情况,流式细胞仪检测细胞株周期的分布,划痕实验检测细胞株迁移能力.结果 Western blotting及RT-PCR检测证明HMGB1 shRNA稳定转染的HUVEC细胞株构建成功,培养72 h时细胞中HMGB1蛋白及mRNA表达较对照细胞明显降低(蛋白:0.436±0.027比1.017±0.038,T=12.180,P=0.000; mRNA:0.436±0.031比1.020±0.051,T=9.660,P=0.001).MTT结果显示,HMGB1 shRNA稳定转染HUVEC细胞株2、3、4、5d的增殖能力比对照细胞株明显下降(2 d:0.210±0.023比0.240±0.011,T=1.050,P=0.351;3 d:0.240±0.022比0.361±0.030,T=3.203,P=0.033;4 d:0.373±0.031比0.531±0.033,T=3.530,P=0.022;5 d:0.441±0.031比0.602±0.030,T=4.180,P=0.106).流式细胞仪检测结果显示,HMGB1 shRNA细胞株在S期的比例明显低于对照细胞株[(13.10±1.10)％比(21.12±1.20)％,T=4.950,P=0.001].划痕实验结果显示,HMGB1 shRNA细胞株在细胞刮除后12h划痕愈合的细胞比例较对照细胞株明显降低[(21.07±3.33)％比(88.53±3.15)％,T=14.142,P=0.000].结论 HMGB1 shRNA能明显抑制HUVEC细胞的增殖和迁移能力.
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人高迁移率族蛋白B1细胞内定位及移位研究
目的观察人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在真核细胞内的定位和移位情况.方法构建人HMGB1及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的哺乳动物细胞表达载体.通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合表达形式克隆到带有血凝素(hytohemagglutinin,HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后转染293A细胞,在荧光显微镜下观察结果.结果重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定证明构建正确,并在293A细胞中得到大量表达.荧光显微镜观察发现,融合蛋白主要分布于细胞核中,经肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激后18 h,部分细胞中融合蛋白从胞核移位到胞质,与预期结果一致.结论 HMGB1的绿色荧光蛋白融合表达载体构建成功.该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位、移位,为下一步深入研究HMGB1作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具.
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整合稳定靶向高迁移率族蛋白B1基因shRNA载体的人脐静脉内皮细胞株建立
目的 构建针对高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)基因的特异性RNA干扰载体,建立稳定转染该干扰载体的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC).方法 根据HMGB1基因的编码序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计并合成针对HMGB1基因的特异性shRNA,将其定向克隆到pRNA-u6.1/Neo载体中,同时设立阴性对照,重组载体经脂质体转染HUVEC;转染细胞经类氨基糖抗生素样物质G418筛选,采用实时荧光逆转录-聚合酶链反应检测HMGB1mRNA表达,蛋白质免疫印迹法检测HMGB1蛋白表达.结果 酶切鉴定和测序证实,重组质粒shRNA序列与设计的片段完全一致.HMGB1基因特异性RNA干扰载体能够显著抑制HMGB1在HUVEC细胞中的表达(mRNA:0.4635±0.0342比1.0340±0.0352,蛋白:0.4510 ± 0.0200比1.0210±0.0110,均P＜0.05).结论 成功构建了靶向HMGB1基因的shRNA真核表达载体pRNA-HMGB1,并获得了稳定表达靶向HMGB1基因的shRNA的HUVEC细胞株,为进一步研究HMGB1在HUVEC细胞株中的生物学功能和作用机制奠定了基础.
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拮抗晚期糖基化终末产物受体对烫伤延迟复苏大鼠多器官功能及死亡率的影响
目的 观察拮抗晚期糖基化终末产物受体(RAGE)对烫伤延迟复苏动物多器官功能及死亡率的影响,并探讨其作用机制.方法 选取雄性Wistar大鼠,采用重度烫伤延迟复苏模型(30%总体表面积Ⅲ度烫伤).实验分为两部分.死亡率观察:130只大鼠被随机分为假手术组(n=10)、烫伤组(n=60)及RAGE抗体治疗组(n=60),观察伤后7 d内每日动物的存活率.器官功能观察:72只大鼠被随机分为假手术组(n=24)、烫伤组(n=24)及RAGE抗体治疗组(n=24),于伤后1、3、5和7 d各活杀6只动物,取血,用全自动生化分析仪测定肝、肾和心脏器官功能指标.结果 烫伤组伤后1～7 d,大鼠血中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐(cr)、尿素氮(BUN)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平均显著高于假手术组(P<0.05或P<0.01),其中ALT、AST、Cr及BUN水平均于伤后3 d达峰值;给予RAGE抗体治疗可不同程度降低烫伤动物血中各指标水平,其中AST在伤后1～7 d显著下降,余指标在伤后1～5 d均明显改善(P<0.05或P<0.01).RAGE抗体治疗组伤后7 d内每日大鼠存活率显著高于烫伤组(P<0.05或P<0.01).结论 RAGE抗体干预能明显改善重度烫伤延迟复苏大鼠的预后,并对重要器官功能具有显著保护作用.
