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重组人促红细胞生成素治疗肾间质纤维化的作用机制研究
目的：探讨重组人促红细胞生成素（rHuEPO）治疗肾间质纤维化（RIF）的作用机制。方法2014年7月—2015年6月，将人肾小管上皮细胞（ HK-2细胞）随机分为7组：空白对照组（ E1组）：未加任何刺激物；rHuEPO 对照组（ E2组）：rHuEPO 终浓度为20 U/ ml；人纯化清蛋白诱导组（ E3组）：人纯化清蛋白终浓度为5 mg/ ml；E4组：加人纯化清蛋白（5 mg/ ml）和 rHuEPO（5 U/ ml）；E5组：加人纯化清蛋白（5 mg/ ml）和 rHuEPO （10 U/ ml）；E6组：加人纯化清蛋白（5 mg/ ml）和 rHuEPO（20 U/ ml）；Rho 相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶（ROCK）抑制剂 Y27632组（E7组）：加 ROCK 抑制剂 Y27632（10μmol/ L），30 min 后加人纯化清蛋白（5 mg/ ml）。采用细胞增殖试验检测刺激16、24、48、72 h 时各组细胞增殖数，反转录-聚合酶链式反应（ RT-PCR）法检测 RhoA、ROCK mRNA 表达水平，细胞免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E -钙黏蛋白（E - cadherin）表达水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测纤维连接蛋白（FN）表达水平。结果16 h 时，各组细胞增殖数比较，差异无统计学意义（P >0.05）。24、48、72 h 时，各组细胞增殖数比较，差异有统计学意义（P <0.05）；其中 E3~ E6组高于 E1组、E2组，E4~ E6组高于 E3组，E7组低于 E3组，E5组、E6组高于 E4组，E6组高于 E5组（ P <0.05）。各组RhoA mRNA 表达水平比较，差异有统计学意义（P <0.05）；其中 E3~ E6组高于 E1组、E2组，E4~ E6组低于 E3组，E5组、E6组低于 E4组，E6组低于 E5组（P <0.05）。各组 ROCK mRNA 表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中 E3~ E6组高于 E1组、E2组，E4~ E7组低于 E3组，E5组、E6组低于 E4组，E6组低于 E5组（P <0.05）。各组α-SMA 表达水平比较，差异有统计学意义（P <0.05）；其中 E3~ E5组高于 E1组、E2组，E4~ E7组低于 E3组，E5组、E6组低于 E4组，E6组低于 E5组（P <0.05）。各组 E - cadherin 表达水平比较，差异有统计学意义（P <0.05）；其中 E3~ E6组低于 E1组、E2组，E4~ E7组高于 E3组，E5组、E6组高于 E4组，E6组高于 E5组（P<0.05）。各组 FN 表达水平比较，差异有统计学意义（P <0.05）；其中 E3~ E5组高于 E1组、E2组，E4~ E7组低于E3组，E5组、E6组低于 E4组，E6组低于 E5组（ P <0.05）。E3组、E4组、E5组、E6组 RhoA mRNA 与 ROCK mRNA 均呈正相关（P <0.05）。结论人纯化清蛋白能诱导 HK-2细胞发生上皮细胞-间充质细胞转分化（EMT），进而发生 RIF，而 rHuEPO 通过阻断 EMT 的 RhoA/ ROCK 信号转导通路从而抑制 RIF 发生，且在一定范围内 rHuEPO 水平越高，其抑制作用越强。
关键词： 肾疾病 细胞转分化 重组人促红细胞生成素 rho 相关激酶类 信号传导 -
特应性皮炎患者外周血 T 淋巴细胞Rho 激酶活性变化及其意义
目的：观察特应性皮炎（AD）患者外周血 T 淋巴细胞中 Rho 激酶活化情况，分析其临床意义。方法收集60例 AD 患者和60例健康儿童外周肝素抗凝血8 ml，分离提取 T 细胞和血清。分别用 AD 血清和健康对照血清培养 AD 患者 T 细胞或健康对照 T 细胞，分为患者 T 细胞+自身血清组、患者 T 细胞+健康对照血清组、健康对照 T 细胞+自身血清组、健康对照 T 细胞+ AD 血清组。此外，分别用 Rho 激酶特异性抑制剂Y27632（Y27632组）、CD3/CD28单抗（CD3/CD28单抗组）、Y27632+ CD3/CD28单抗（Y27632+ CD3/CD28单抗组）处理 AD 患者 T 细胞，自身血清培养 AD 患者 T 细胞为患者 T 细胞组。采用 Western 印迹法检测各组 Rho 激酶活性，四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测 T 细胞增殖活性，ELISA 检测白细胞介素（IL）6、IL-10水平。结果新鲜分离的 AD 患者外周血 T 细胞 Rho 激酶活性（2.47%±0.89%）显著高于健康对照组（0.65%±0.35%，t =2.729， P ＜0.05）。AD 患者 T 细胞在体外经10%胎牛血清培养24 h 后 Rho 激酶活性（0.70%±0.38%）较培养前显著降低（t =2.658，P ＜0.05），但与培养24 h 后健康对照 T 细胞（0.63%±0.32%）相比，差异无统计学意义（t =1.010， P ＞0.05）。与健康对照血清培养 T 细胞相比，AD 血清培养 T 细胞会增加 Rho 激酶活性（F =8.22，P ＜0.001），患者 T 细胞+自身血清培养24 h 后 Rho 激酶活性（2.41%±0.87%）明显高于患者 T 细胞+健康对照血清组（0.76%±0.41%），健康对照 T 细胞+ AD 血清组（2.17%±0.85%）显著高于健康对照 T 细胞+自身血清组（0.64%±0.33%），差异均有统计学意义（P ＜0.05）。Y27632可显著抑制 AD 患者 T 细胞的增殖和 IL-6的分泌（F =18.68、22.95，P ＜0.001），Y27632组 T 细胞增殖率、IL-6的表达均显著低于患者 T 细胞组（均 P ＜0.05），且Y27632+ CD3/CD28单抗组也显著低于 CD3/CD28单抗组（均 P ＜0.05），而 Y27632对 AD 患者 T 细胞 IL-10分泌无显著影响。结论 AD 患者 T 淋巴细胞存在 Rho 激酶信号活化异常，提示 Rho 激酶信号异常在 AD 发病过程中可能发挥着一定的作用。
