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人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定
目的：：探讨和建立适用于人心肌成纤维细胞体外培养及鉴定的技术方法。方法：从将进行心脏手术患者体内取右心耳组织，用胰蛋白酶消化法消化分离细胞，再通过差速贴壁分离法收集心肌成纤维细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养并传代，光学显微镜下观察心肌成纤维细胞基本形态特征的变化，波形蛋白(Vimentin)，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，Ⅷ因子(VWF)抗体对细胞进行免疫荧光鉴定。结果：形态学观察和免疫荧光鉴定显示，成功培养心肌成纤维细胞，纯度达95%以上。结论：胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法及免疫荧光鉴定是一种简单有效的人心肌成纤维细胞培养方法。建立了一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养模型。
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反复胰蛋白酶消化法培养SD大鼠视网膜Muller细胞
目的:通过反复胰蛋白酶消化法,建立Muller细胞的培养和纯化方法.方法:采用新生7天的SD大鼠,解剖镜下取视网膜,反复胰蛋白酶消化法消化贴壁后的细胞,细胞形态一致后行免疫组织化学和形态学检查.结果:所得细胞的90%左右谷氨酰胺合成酶(CS)免疫组化染色阳性;荧光显微镜下可见细胞胞体巨大,足突明显,证明是Muller细胞.结论:反复胰蛋白酶消化法是一种简单、可靠的Muller细胞培养方法.
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不同浓度补肾健脾方对卵巢颗粒细胞增殖作用的影响
目的:观察不同浓度补肾健脾方含药血清对原代培养的卵巢颗粒细胞增殖作用的影响以及不同浓度补肾健脾方对小鼠卵巢组织卵泡颗粒细胞层增殖的影响.方法:采用机械分离法结合胰蛋白酶消化法体外原代培养大鼠卵巢颗粒细胞,通过HE染色法进行细胞形态鉴定.采用MTT法检测,分别观察合质量分数5％、10％、20％补肾健脾方含药血清对卵巢颗粒细胞增殖作用的影响.体内实验通过给雌性小鼠灌胃不同浓度的补肾健脾方,连续灌胃4周,取卵巢组织做病理形态学观察.结果:质量分数20％、10％、5％的补肾健脾方含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞增殖作用各不相同,质量分数20％、10％的含药血清、20％的空白血清对卵巢颗粒细胞的增殖作用明显,与正常组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05).补肾健脾方大剂量、中剂量、小剂量对卵巢卵泡颗粒细胞层的厚度呈现一定的增高趋势.结论:补肾健脾方对小鼠的卵巢颗粒细胞具有一定的增殖作用.
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完整视网膜毛细血管网消化铺片技术及细胞计数方法的改进
背景 以往视网膜血管消化铺片法仅能够获得部分视网膜血管,无法客观评价全视网膜血管的病理改变,因此进一步获得完整的视网膜血管网是相关疾病实验研究和临床研究的基础. 目的 在国外对全视网膜血管消化铺片技术的基础上进行改良,建立全视网膜血管的铺片方法. 方法 30只健康Wistar 大鼠随机数字表法分为模型组和对照组,模型组20只大鼠用溶于0.05 mmol/L柠檬酸缓冲液的质量分数1.25％链脲佐菌素(STZ)腹腔内注射法制作糖尿病模型,对照组10只大鼠以同样的方法注射等容量柠檬酸缓冲液.注射后8个月经左心室注射PBS 100 ml,剪开右心房使血液及PBS流出后注射质量分数4％多聚甲醛100 ml,摘除眼球,将完整剥离的大鼠视网膜先进行胰蛋白酶消化,然后剥离玻璃体及内界膜,去除视网膜神经组织,得到完整的视网膜毛细血管网,平铺于载玻片上,将视网膜毛细血管网以视盘为中心划为内、中、外3个区域,采用盲法在光学显微镜下判定和计数中间区域影周细胞及无细胞血管. 结果 视网膜铺片显示,大鼠的视网膜血管为全血管型,可见放射状的视网膜中央动脉与视网膜中央静脉主干及逐级分支结构、小动脉与小静脉之间表浅层和深层的毛细血管网.周细胞略突出于血管管壁,在其形成影周细胞时,原有的细胞核缺失.无细胞血管的管径为邻近毛细血管管径的20％以上,并且在整个血管上无细胞核和影周细胞.结论 全视网膜消化铺片技术能够提供实验所需的完整视网膜毛细血管网,配合细胞计数方法,能够较好地评价视网膜的形态改变,并为视网膜血管和管壁细胞的定量分析提供有利条件.
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四种纯化弓形虫速殖子方法对虫体RNA影响的比较
目的 比较纯化弓形虫速殖子的四种方法对虫体RNA的影响.方法 以2.0×105个速殖子腹腔接种于昆明小鼠,72h后收集小鼠腹腔液,以胰蛋白酶消化法、微孔滤膜过滤法、G3滤斗和CF-11纤维素柱法纯化弓形虫速殖子,用AGPC法抽提总RNA, 用甲醛变性胶电泳检测总RNA.结果 胰蛋白酶消化法虫体回收率大,但时间长,易造成RNA降解;微孔滤膜过滤法回收率低;G3滤斗纯度不高;CF-11纤维素柱法快速简单、纯度高,对RNA无影响.结论 微孔滤膜过滤法、CF-11纤维素柱法对虫体RNA的影响小,较适用于cDNA文库构建时虫体的分离纯化.
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大鼠视网膜神经细胞的原代培养
目的:在前人建立的方法上优化SD大鼠视网膜神经细胞体外培养的技术和方法,为后续研究提供实验基础.方法:使用胰酶消化法分离新生1～3d SD大鼠视网膜神经细胞,以DMEM/F12为培养基体外培养,免疫组织化学染色的方法进行鉴定.结果:观察光镜下培养的细胞贴壁生长,部分细胞伸出突起,且有些突起相互连接.免疫细胞化学染色显示,培养的细胞大多数抗神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)抗体反应阳性.结论:视网膜神经细胞体外培养成功为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件.
关键词： 细胞培养 视网膜神经元 胰蛋白酶消化法 神经元特异性烯醇化酶
