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多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对视网膜血管内皮细胞IGF-1/VEGF信号通路的抑制作用
背景 视网膜新生血管(RNV)是多种眼底血管疾病的共同表现,研究证实胰岛素样生长因子(IGF-1)能够刺激血管内皮细胞的增生,从而促进新生血管的形成,而多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)在IGF-1信号转导的过程中发挥转录抑制的作用.但PSF在RNV形成过程中的作用尚不清楚.目的 研究PSF对IGF-1/血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的调控作用.方法 将猕猴视网膜血管内皮细胞RF/6A进行培养后分为Pegfp-C2-PSF质粒转染组、pGenesil-PSF-RNAi质粒转染组及各自的对照组,分别在细胞中转入真核质粒Pegfp-C2-PSF、pGenesil-PSF-RNAi及相应的空白质粒.各组细胞培养液中分别添加或不添加胰岛素样生长因子1(IGF-1)以刺激细胞生长,采用MTT法检测各组RF/6A细胞的增生率并筛选各组适PSF剂量,用于进一步的实验.采用逆转录PCR法测定和比较不同PSF转染组间用或不用U0126处理组间RF/6A细胞中VEGF mRNA的表达;采用Western blot法验证PSF对IGF-1诱导的细胞外调节蛋白激酶(ERK)活化的促进作用.结果 IGF-1刺激后Pegfp-C2-PSF质粒转染组以0.50 μg PSF为适剂量,其RF/6A细胞的增生率为0.220±0.020,细胞中VEGF mRNA相对表达量为0.79±0.07,分别低于其对照组的0.260±0.006和未转染组的1.26±0.19,差异均有统计学意义(P=0.040、0.016);IGF-1刺激后pGenesil-PSF-RNAi质粒转染组以1.00 μg PSF作为适剂量,其RF/6A细胞增生率为0.35±0.02,VEGF mRNA相对表达量为2.29±0.43,分别高于其对照组的0.210±0.019和未转染组的1.26±0.19,差异均有统计学意义(P=0.003、0.019).IGF-1刺激后1、3、6 h Pegfp-C2-PSF质粒转染组细胞中pERK蛋白表达量均明显低于未转染组,差异均有统计学意义(P=0.017、0.000、0.000).Pegfp-C2-PSF质粒转染组U0126+处理后细胞中VEGF mRNA的相对表达量为0.93±0.21,明显低于未转染组的1.32±0.08,差异均有统计学意义(P=0.037),同时明显低于Pegfp-C2-PSF质粒转染组无U0126处理的细胞中VEGF mRNA的相对表达量1.23±0.09,差异有统计学意义(P=0.002).结论 PSF可抑制IGF-1诱导的RF/6A细胞中的ERK信号通路的活化,下调VEGF在RF/6A细胞中的表达,进而抑制RF/6A细胞的增生.
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完整视网膜毛细血管网消化铺片技术及细胞计数方法的改进
背景 以往视网膜血管消化铺片法仅能够获得部分视网膜血管,无法客观评价全视网膜血管的病理改变,因此进一步获得完整的视网膜血管网是相关疾病实验研究和临床研究的基础. 目的 在国外对全视网膜血管消化铺片技术的基础上进行改良,建立全视网膜血管的铺片方法. 方法 30只健康Wistar 大鼠随机数字表法分为模型组和对照组,模型组20只大鼠用溶于0.05 mmol/L柠檬酸缓冲液的质量分数1.25％链脲佐菌素(STZ)腹腔内注射法制作糖尿病模型,对照组10只大鼠以同样的方法注射等容量柠檬酸缓冲液.注射后8个月经左心室注射PBS 100 ml,剪开右心房使血液及PBS流出后注射质量分数4％多聚甲醛100 ml,摘除眼球,将完整剥离的大鼠视网膜先进行胰蛋白酶消化,然后剥离玻璃体及内界膜,去除视网膜神经组织,得到完整的视网膜毛细血管网,平铺于载玻片上,将视网膜毛细血管网以视盘为中心划为内、中、外3个区域,采用盲法在光学显微镜下判定和计数中间区域影周细胞及无细胞血管. 结果 视网膜铺片显示,大鼠的视网膜血管为全血管型,可见放射状的视网膜中央动脉与视网膜中央静脉主干及逐级分支结构、小动脉与小静脉之间表浅层和深层的毛细血管网.周细胞略突出于血管管壁,在其形成影周细胞时,原有的细胞核缺失.无细胞血管的管径为邻近毛细血管管径的20％以上,并且在整个血管上无细胞核和影周细胞.结论 全视网膜消化铺片技术能够提供实验所需的完整视网膜毛细血管网,配合细胞计数方法,能够较好地评价视网膜的形态改变,并为视网膜血管和管壁细胞的定量分析提供有利条件.
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结缔组织生长因子重组干扰载体慢病毒颗粒的构建及其对视网膜血管内皮细胞内源性结缔组织生长因子表达的抑制作用
目的 构建结缔组织生长因子(CTGF)重组干扰载体(shRNA),观察其对视网膜血管内皮细胞内源性CTGF表达的抑制作用.方法 构建人源CTGF shRNA,应用三质粒包装系统获得高滴度的CTGFshRNA慢病毒颗粒.感染视网膜血管内皮细胞,利用干扰载体中的红色荧光标记示踪并筛选慢病毒的佳感染复数及起效时间.将细胞分为空白对照组(正常培养)、感染对照组(Scramble shRNA病毒感染)及CTGF敲低组(CTGF shRNA病毒感染).通过Transwell细胞迁移实验观察3组细胞的迁移能力;实时定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测3组细胞的结缔组织生长因子(CTGF)、纤连蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原蛋白(Col I)的mRNA和蛋白表达.3组间数据比较采用方差分析.结果 CTGFshRNA的佳感染复数为20,佳起效时间是72 h.Transwell细胞迁移实验结果显示,CTGF敲低组穿过小孔细胞数较空白对照组及感染对照组明显降低,差异均有统计学意义(F=20.64,P=0.002).实时定量PCR及Western blot检测结果显示,CTGF敲低组CTGF、FN、α-SMA、Col ImRNA(F=128.83、124.44、144.76、1 374.44,P=0.000、0.000、0.000、0.000)和蛋白表达(F=22.55、41.60、25.73、161.68,P=0.002、0.000、0.001、0.000)较空白对照组、感染对照组明显降低,差异均有统计学意义.结论 成功构建的CTGF shRNA慢病毒颗粒可有效抑制视网膜血管内皮细胞迁移并下调内源性CTGF的表达.
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高糖状态下视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA-Seq分析
目的 观察高糖状态下视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA-Seq分析结果.方法 体外培养视网膜血管内皮细胞,取对数生长期细胞用于实验.将细胞分为对照组、高糖组,两组细胞分别采用5、25 mmol/L的葡萄糖持续培养48 h.应用RNA-Seq技术对两组细胞进行全转录组测序,获得生物学大数据,并在此基础上分析差异表达基因;通过GO功能、Pathway显著性富集分析对差异基因的功能及所在的信号通路进行解释说明.结果 对照组和高糖组之间共有449个差异表达基因.其中,上调基因297个,下调基因152个.差异基因功能涉及分子生物学过程调控以及细胞的能量代谢、蛋白合成等诸多方面,其中ITGB 1BP2、NCF1、UNC5C等与炎症的产生相关;AKR1 C4、ATP1A3、CHST5、LCTL等与细胞的能量代谢相关;DAB1、PRSS55等与蛋白合成相关;SMAD9、BMP4等与细胞外基质的代谢相关.GO功能显著性富集分析结果显示,差异基因的功能主要可以划分为生物学行为调控,细胞组分形成以及分子功能三大板块,主要集中表现在生物学过程部分的系统形成和调节多细胞有机体的形成等.Pathway显著性富集分析前20条具有明显差异的通路,发现差异表达比较明显的是转化生长因子-β(TGF-β)信号通路、补体通路等,色氨酸、丝氨酸、氰氨酸等与氨基酸代谢相关的通路也受到了影响.其中,白细胞抑制因子9、骨形成蛋白4通过TGF-β信号通路发挥作用.结论 高糖通过破坏视网膜血管内皮细胞的跨膜传导、细胞外基质代谢以及蛋白质的转录和翻译等,从而影响视网膜血管内皮细胞的功能.
关键词： 视网膜血管/细胞学 内皮细胞 基因表达谱 糖尿病视网膜病变/病因学 -
抗血管内皮生长因子药物治疗后视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA-Seq分析
目的 观察抗血管内皮生长因子(VEGF)药物治疗后视网膜血管内皮细胞基因表达谱的RNA-Seq分析结果.方法 体外培养视网膜血管内皮细胞,取对数生长期细胞用于实验.将细胞分为VEGF组、VEGF联合抗VEGF药物组.VEGF组细胞采用50 ng/ml VEGF持续作用72 h,以模拟糖尿病视网膜病变中血管内皮细胞的高VEGF生存环境.VEGF联合抗VEGF药物组细胞采用50 ng/ml VEGF+2.5 μg/ml抗VEGF药物持续作用72 h,以仿效抗VEGF药物治疗后细胞所处的微环境.应用RNA-Seq技术对两组细胞进行全转录组测序,获得生物学大数据,并在此基础上分析差异表达基因;通过GO功能、Pathway显著性富集分析对差异基因的功能及所在的信号通路进行解释说明.结果 分别获得两组细胞的基因表达谱信息.两组细胞之间共存在328个差异表达基因,包括194个上调基因和133个下调基因.差异基因功能涉及分子生物学过程调控以及细胞的能量代谢、蛋白合成等诸多方面,其中SI、PRX、HPGD与蛋白合成相关,BIRC7与细胞凋亡相关,而ABLIM1、CRB2与视网膜发育相关,ABCG1、ABCA9、ABCA12与巨噬细胞胆固醇和磷脂转运相关.GO功能显著性富集分析结果显示,差异基因的功能主要可以划分为生物学行为调控、细胞组分形成以及分子功能三大板块.Pathway显著性富集分析结果显示,Notch信号通路、细胞外基质受体通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、转化生长因子-β(TGF-β)信号通路、Wnt信号通路表达在两组细胞间存在差异,而其中又以与纤维化进程调控密切相关的TGF-β信号通路中钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱβ(CAMK2B)、胶原蛋白Ⅲ型α1链(COL3A1)、细胞球蛋白(CYGB)、前列腺素E受体2(PTGER2)、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2等基因的差异表达为引人关注.结论 抗VEGF药物治疗后可能导致CAMK2B、COL3A1、CYGB、PTGER2等TGF-β通路相关基因的表达上调进而加剧视网膜纤维化进程.
关键词： 视网膜血管/细胞学 内皮细胞 基因表达谱 血管生成抑制剂/治疗应用 -
姜黄素对高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡的影响
目的 观察姜黄素对高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞(RRVEC)凋亡的影响.方法 取对数生长期原代培养的第4代RRVEC进行实验,采用免疫荧光染色法鉴定培养的细胞,并对内皮细胞的特异性标志物血管性假性血友病因子(vWF)的表达进行检测.将培养的RRVEC分为对照组、高糖组和姜黄素干预组.对照组细胞正常培养.高糖组细胞经30 mmol/L的葡萄糖培养.姜黄素干预组细胞经30 mmol/L的葡萄糖培养24 h后,再加入30μmol/L姜黄素处理24 h.采用流式细胞仪检测各组细胞内活性氧(ROS)相对含量及细胞凋亡的变化情况.采用免疫细胞化学染色法检测各组细胞中核因子(NF)-κB p65的蛋白表达.采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关x蛋白(Bax)的蛋白表达.结果 分离得到的RRVEC在1周后呈铺路石样单层贴壁生长.培养获得的细胞vWF表达呈强阳性.对照组、高糖组及姜黄素干预组RRVEC中ROS相对含量、细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(F=40.957、325.137,P=0.000、0.000).与对照组比较,高糖组RRVEC中ROS相对含量、细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(t=8.677、25.500,P=0.000、0.000).与高糖组比较,姜黄素干预组RRVEC中ROS相对含量、细胞凋亡率明显降低,差异有统计学意义(t=6.568、12.818,P=0.000、0.000).与对照组比较,高糖组RRVEC中NF-κB p65(t=8.322,P=0.000)、Bax(t=3.813,P=0.009)蛋白表达明显增加,Bcl-2蛋白表达(t=4.362,P=0.005)及Bcl-2/Bax比值(t=6.449,P=0.001)明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).与高糖组比较,姜黄素干预组RRVEC中NF-κB p65、Bax(t=2.577、3.059,P=0.042、0.022)蛋白表达明显降低,Bcl-2/Bax比值(t=3.831,P=0.009)明显提高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 姜黄素能抑制高糖诱导的RRVEC凋亡,其机制可能与增强Bcl-2表达、下调Bax表达从而抑制NF-κB信号通路有关.
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高糖缺氧环境下转甲状腺素蛋白对人视网膜血管内皮细胞生长抑制作用机制
目的 探讨高糖缺氧环境下转甲状腺素蛋白(TTR)对人视网膜血管内皮细胞(hREC)生长抑制作用的机制.方法 将hREC分为正常组、高糖组、正常缺氧组、高糖缺氧组、正常+TTR组、高糖+TTR组、正常缺氧+TTR组及高糖缺氧+TTR组,各组细胞均置于Dulbecco改良Eagle培养基中培养.正常组、正常缺氧组培养基中加入5.5 mmol/L葡萄糖;高糖组、高糖缺氧组培养基中加入25.0 mmol/L葡萄糖;正常缺氧组、高糖缺氧组培养基中加入200μmol/L氯化钴;正常+TTR组、高糖+TTR组、正常缺氧+TTR组及高糖缺氧+TTR组除高糖及缺氧诱导外,于细胞贴壁后再加入4μmol/L TTR.采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞磷酸激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)及Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达量.结果 正常缺氧组较正常组(χ2=25.360)、高糖缺氧组较高糖组(χ2=17.400)、高糖缺氧+TTR组较高糖缺氧组(χ2=9.900)均表现为细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05).正常组与高糖组(χ2=0.010)、正常组与正常+TTR组、高糖组与高糖+TTR组、正常缺氧组与正常缺氧+TTR组之间细胞凋亡率比较,差异均无统计学意义(P>0.05).Western blot检测结果显示,各组Akt蛋白表达比较,差异无统计学意义(F=2.450,P>0.05).正常缺氧组较正常组(t=9.406、5.306、4.819、-4.503)、高糖缺氧组较高糖组(t=8.877、7.723、6.500、-14.646)均表现为p-Akt、eNOS、Bcl-2蛋白表达量明显减少,Bax蛋白表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05).与正常缺氧组比较,正常缺氧+TTR组p-Akt蛋白表达量增加(t=-5.024,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05);eNOS、Bcl-2、Bax蛋白表达量无明显变化,差异无统计学意义(t=-2.235、-2.656、-0.272,P>0.05).与高糖缺氧组比较,高糖缺氧+TTR组p-Akt、Bcl-2蛋白表达量明显减少(t=4.355、4.308),Bax蛋白表达量明显增加(t=-4.311),差异有统计学意义(P<0.05);eNOS蛋白表达量无明显变化,差异无统计学意义(t=-1.590,P>0.05).高糖组与正常组、正常+TTR组与正常组、高糖+TTR组与高糖组之间p-Akt、eNOS、Bcl-2、Bax蛋白表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 高糖缺氧环境下TTR对hREC生长抑制作用的机制与Akt/Bcl-2/Bax信号通路有关,而与Akt/eNOS信号通路无关.
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精氨酸酶抑制剂对体外高糖培养的恒河猴视网膜微血管内皮细胞的保护作用
目的 观察精氨酸酶(Arg)抑制剂N羟基-正-L精氨酸(nor-NOHA)对体外高糖培养的恒河猴视网膜微血管内皮细胞(RF/6A细胞)的保护作用.方法 体外培养RF/6A细胞,并将其分为正常对照组(A组)、高糖对照组(B组)、高糖+nor-NOHA处理组(C组)、高糖+二甲基亚砜(DMSO)对照组(D组).A组细胞以5.5 mmol/L葡萄糖继续培养;B～D组以25.0 mmol/L葡萄糖继续培养,C、D组分别加入125 mg/L的nor-NOHA及1％DMSO.采用噻唑蓝比色法、Transwell小室法和体外成管实验分别检测各组RF/6A细胞增生、迁移和管腔形成能力.采用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组RF/6A细胞中ArgⅠ、内皮型一氧化氮(NO)合酶(eNOS)、诱导型NO合酶(iNOS)的mRNA相对表达量.采用酶链免疫吸附测定试验(ELISA)检测各组RF/6A细胞培养上清液中NO和白细胞介素(IL)-1b的分泌量.结果 B组RF/6A细胞增生、凋亡及管腔形成能力较A组明显降低,差异有统计学意义(t=2.367、5.633、7.045,P＜0.05);C组RF/6A细胞增生、凋亡及管腔形成能力较B组提高,差异有统计学意义(t=5.260、6.952、8.875,P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,与A组比较,B组RF/6A细胞中Arg Ⅰ、iNOS mRNA相对表达量升高(t=6.836、3.342),C组RF/6A细胞中Arg Ⅰ、iNOS mRNA相对表达量降低(t=4.904、7.192),差异均有统计学意义(P＜0.05);B组RF/6A细胞中eNOS mRNA相对表达量降低(t=4.165),C组RF/6A细胞中eNOSmRNA相对表达量升高(t=6.594),差异均有统计学意义(P＜0.05).ELISA检测结果显示,与A组比较,B组RF/6A细胞培养上清液中NO分泌量减少(t=4.925),C组RF/6A细胞培养上清液中NO分泌量增多(t=5.368),差异均有统计学意义(P＜0.05);B组RF/6A细胞培养上清液中IL-1b分泌量增多(t=5.032),C组RF/6A细胞培养上清液中IL-1b分泌量减少(t=7.792),差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 nor-NOHA对体外高糖培养的RF/6A细胞有保护作用,可提高其增生、迁移及管腔形成能力;其机制可能是通过平衡Arg/NOS的表达从而抑制氧化应激反应.
关键词： 精氨酸酶/拮抗剂和抑制剂 视网膜血管/细胞学 内皮细胞/生理学 细胞 培养的 -
转甲状腺素蛋白对视网膜微血管内皮细胞生物学行为的影响
目的：观察转甲状腺素蛋白(TTR)对视网膜微血管内皮细胞(RMVEC)生物学行为的影响。方法培养的 RMVEC 依照 TTR 浓度不同分为0(初始浓度)、4μmol/L 组。培养48 h 后,噻唑蓝(MTT)比色法、细胞迁移实验分别检测不同浓度 TTR 对 RMVEC 增生、迁移的影响。细胞划痕实验检测培养0(初始时间)、24、48 h 时细胞损伤愈合情况。结果MMT 比色法检测结果显示,初始浓度组、4μmol/L 组吸光度[A,旧称光密度(OD)]值分别为0.17±0.02、0.40±0.03。两组 A 值比较,差异有统计学意义(t =15.47,P =0.0001)。细胞迁移实验结果显示,初始浓度组、4μmol/L 组 RMVEC 向外迁移数分别为(140±7)、(227±14)个。两组间 RMVEC 向外迁移数比较,差异有统计学意义(t=5.44,P =0.0006)。细胞划痕实验结果显示,初始时间各组细胞划痕距离大致相等；24 h,初始浓度组、4μmol/L 组细胞划痕愈合距离分别为(134.4±45.4)、(330.0±23.1)μm。两组细胞划痕愈合距离比较,差异有统计学意义(t =8.25,P <0.01)。48 h,4μmol/L 组完全愈合,初始浓度组未愈合。结论TTR 对 RMVEC 增生、迁移和损伤愈合有明显促进作用。
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高糖缺氧环境下转甲状腺素蛋白对视网膜血管内皮细胞的影响
目的 观察高糖缺氧环境下转甲状腺素蛋白(TTR)对人视网膜血管内皮细胞(hREC)的影响.方法 分别于5.5 mmol/L葡萄糖(低糖,LG)、25.0 mmol/L葡萄糖(高糖,HG)以及200 μmol/LCoCl2诱导的缺氧环境中培养hREC、人视网膜色素上皮细胞(hRPEC),并据此分为LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组.实时无标记细胞功能分析仪检测细胞培养初始时间(0 h)及培养后4、8、16、24、36、48、60、72 h的细胞生长指数.分别在LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组细胞培养基中添加4μmol/L TTR,即LG组+TTR、LG缺氧组+TTR、HG组+TTR、HG缺氧组+TTR,观察TTR对hREC和hRPEC的作用以及hRPEC对hREC生长的影响.Transwell共培养体系观察hPEPC对hREC生长影响.结果 培养后72 h,LG组hREC、hRPEC生长指数明显高于LG缺氧组、HG组,差异均有统计学意义(hREC:F=17.098、22.970,P＜0.05;hRPEC:F=45.442、9.011,P＜0.05);HG组、HG缺氧组hREC、hRPEC生长指数显著降低,差异均有统计学意义(hREC:F=146.184,P＜0.05;hRPEC:F=27.907,P＜0.05).HG组+TTR、HG缺氧组+TTR hREC生长指数显著低于HG组、HG缺氧组,两组hREC生长指数比较,差异有统计学意义(F=161.430、24.106,P＜0.05);LG组+TTR、LG缺氧组+TTR hREC生长指数高于LG组,LG缺氧组,两组hREC生长指数比较,差异有统计学意义(F=200.486、48.662,P＜0.05).LG组+TTR、LG缺氧组+TTR、HG组+TTR、HG缺氧组+TTR hRPEC生长指数均较LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组略高,但差异无统计学意义(P＞0.05).共培养与单独生长细胞相比,共培养hRPEC对hREC生长有显著抑制作用,差异有统计学意义(LG组:F=15.711,P＜0.05;LG缺氧组:F=45.659,P＜0.05;HG组:F=7.857,P＜0.05;HG缺氧组:F=6.348,P＜0.05).结论 高糖缺氧环境下TTR对hREC生长有抑制作用.
