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PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体的构建
目的 构建蛋白质转导结构域4-铜锌超氧化物歧化酶(PTD4-Cu,Zn-SOD)原核重组表达载体.方法 利用基因重组技术,设计Cu,Zn-SOD特异性引物和PTD4寡核苷酸序列,Cu,Zn-SOD基因进行PCR反应,产物进行鉴定、回收和纯化,以pET16b为载体,经Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切反应、连接反应和质粒转化,构建pET16b-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,再分别将PTD4基因和pET16b-Cu,Zn-SOD载体经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切反应、连接反应和质粒转化,构建pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,并进行限制性内切酶谱分析和基因测序.结果 成功构建了长度为6 207 bp的pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,用Nde Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,得到约5.7 kb的载体片段和约510 bp的PTD4-Cu,Zn-SOD基因片段,与预期结果一致.pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体基因测序结果与预期的基因序列相比,碱基序列均正确.结论 成功构建了PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体.
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PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白的制备
目的 制备蛋白质转导结构域4-铜锌超氧化物歧化酶(PTD4-Cu,Zn-SOD)融合蛋白.方法 分别将pET16b-Cu,Zn-SOD蛋白和pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞E.coli BL21 (DE3)中;加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(终浓度0.84 mmol/L)孵育4h,诱导Cu,Zn-SOD和PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白表达;经过溶菌酶和超声裂解细菌,取上清液,行15％ SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达情况.利用Ni-NTA His结合树脂在天然条件下纯化获得Cu,Zn-SOD蛋白和PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白,采用Western blot法鉴定目的蛋白.结果 Western blot结果显示目的蛋白纯度为90％,可见分子量约为19 kDa的Cu,Zn-SOD蛋白条带和分子量约为20 kDa的PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白条带.结论 成功制备了PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白.
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Tat穿膜肽的临床应用研究进展
穿膜肽Tat(transcriptional activator protein)是一种带正电荷的短肽,可以协助大分子物质进入哺乳动物细胞.近的研究表明,多种与Tat融合的物质能够穿过细胞膜而且可以发挥其生物学功能.这项技术对结合物的大小没有严格的限制,即使是原本无法使用的大分子物质也有可能用于治疗疾病.Tat已经在肿瘤、糖尿病、免疫治疗等临床领域展现出很大的研究价值,并且已经取得了不少新的进展,具有广泛的应用前景.
