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1585例正常人及不同甲状腺疾病患者血清TRAb水平的临床研究
目的 以制备的富含甲状腺刺激性抗体(TSAb)抗原决定簇的重组TrxTSHRn蛋白为抗原,建立酶联免疫吸附(ELISA)技术确定促甲状腺激素受体抗体(TRAb)的阳性切限值,并初步应用于临床.方法 以重组TrxTSHRn蛋白为抗原,通过不同的抗原包被量、不同的样品血清稀释度优化,建立间接ELISA检测方法(TRAb-N ELISA以检测TSAb为主).以此方法检测正常成人组1060例(年龄18 ～81岁),健康儿童27例及非自身免疫性疾病儿童(肺炎患儿)88例(年龄0～14岁,平均3.8岁),确定阳性切限值.检测不同甲状腺疾病患者血清TRAb水平.结果 TRAb-N ELISA检测正常成人组405 nm处吸光度A.值((x)±s)为0.398±0.167,儿童组为0.186±0.094,二者差异有统计学意义.亚组分析中,不同性别组之间及正常成人组各年龄段之间差异无统计学意义.成人组阳性切限值((x)+2s)为0.732,阳性率2.45％ (26/1 060).初发Graves病患者阳性率70.31％(74/105)、治疗1年Graves病患者阳性率35.70％(10/28)、桥本甲状腺炎患者阳性率36.67％ (44/120)、单纯甲状腺肿患者阳性率4.60％ (2/43)、亚急性甲状腺炎患者阳性率6.67％( 3/45)、非毒性结节性甲状腺肿患者阳性率7.25％(5/69).结论 儿童血清TSAb水平显著低于成人,而不同年龄、性别的成人之间TSAb水平无差异.初发Graves病患者TSAb阳性率较高,因此TSAb可用于Graves病的诊断、疗效观察及判断预后.
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稳定表达全长人促甲状腺激素受体细胞株构建及功能评价
目的 建立能稳定表达全长人促甲状腺激素受体的细胞株并对其进行功能鉴定.方法 利用PCR方法钓取全长人促甲状腺激素受体(hTSHR)基因,纯化后交换进入线性化GV208载体,构建出重组载体,载体转化后在辅助包装原件载体质粒的帮助下包装成慢病毒颗粒,感染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),单克隆培养后筛选出稳定表达 hTSHR 的细胞,用 qPCR 检测其 mRNA 表达情况.用牛 TSH (bTSH)或Graves病患者血清刺激细胞,检测上清cAMP浓度变化来鉴定构建的细胞株功能.结果 基因检测证明阳性转化子目的基因序列正确.与对照组或空白组细胞相比,构建的实验组细胞株表达的hTSHR mRNA升高,在受到bTSH刺激时,随着bTSH浓度增加,cAMP明显增高,初发Graves病患者血清刺激细胞时,与对照组血清相比cAMP明显增高.结论 构建的CHO细胞株能稳定表达全长人促甲状腺激素受体,并且该细胞株功能良好,可用于后续研究.
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环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中的应用
目的 采用环状定点诱变技术将重组真核表达质粒pcDNA3.1-hTSHR中hTSHR cDNA序列上发生突变的单碱基诱变回正常的序列.方法 设计1对含预期突变的完全互补的诱变引物,以环状质粒为模板进行PCR扩增,得到带缺口的突变质粒,酶消化去除模板质粒,将PCR产物转化DH5α感受态细胞进行缺口修复和克隆.结果 DNA测序表明,在预期位点已成功发生诱变,且目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变.结论 环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的诱变方法,通过该方法成功实现了目的碱基的定点诱变,为后续研究奠定了基础.
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人促甲状腺激素受体HEK293T细胞稳定表达株的构建
目的 构建人促甲状腺激素受体(hTSHR)稳定表达株,用于研究抗甲状腺新药.方法 AgeⅠ/NheⅠ双酶切载体GV266和hTSHR基因,T4连接酶连接构建GV266-hTSHR表达质粒.转染GV266-hTSHR到293T细胞后,Western blot证明hTSHR表达.用Opti-MEM、Lipofectamine 2000、辅助质粒在293T细胞构建GV266包装质粒.qPCR测定包装病毒滴度.用GV266包装质粒、GV266-hTSHR表达质粒共转染293T细胞获得GV266-hTSHR-293T稳定表达株.绿色荧光蛋白(GFP)荧光鉴定稳定表达株.结果 GV266-hTSHR构建物阳性大肠杆菌克隆的DNA测序结果与hTSHR序列比对100％吻合.Western blot显示,过表达hTSHR的HEK293T细胞出现相对分子质量为62×103的目的条带.qPCR测定包装质粒滴度达到了2×108TU/mL.GV266-hTSHR-293T细胞稳定表达株表达GFP荧光.结论 构建了GV266-hTSHR表达质粒,获得了GV266-h TS HRHEK 293T稳定表达株,为研究抗甲状腺多肽提供了必要的实验材料.
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pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达
目的:构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体(hTSHR)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中进行表达.方法:以限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切pBluescript SK(-)/hT-SHR,获得hTSHR cDNA的全长片段,在以低熔点琼脂糖回收纯化后,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR,进行酶切、PCR及测序鉴定.通过脂质体介导,转染COS-7细胞进行瞬时表达,并用RT-PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达.结果:双酶切pBluescript SK(-)/hTSHR得到约2 700 bp含TSHR全长cDNA的片段,同预期片段的大小相符.所构建的pcDNA3.1/hTSHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符;测序结果与GenBank中收录的hTSHR全长序列一致,表明真核表达质粒构建正确.以脂质体转染COS-7细胞后,用RT-PCR和免疫细胞化学染色法检测表明,细胞可表达hTSHR.结论:成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR,为进一步研究TSHR的功能,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础.
