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pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达
目的:构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体(hTSHR)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中进行表达.方法:以限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切pBluescript SK(-)/hT-SHR,获得hTSHR cDNA的全长片段,在以低熔点琼脂糖回收纯化后,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR,进行酶切、PCR及测序鉴定.通过脂质体介导,转染COS-7细胞进行瞬时表达,并用RT-PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达.结果:双酶切pBluescript SK(-)/hTSHR得到约2 700 bp含TSHR全长cDNA的片段,同预期片段的大小相符.所构建的pcDNA3.1/hTSHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符;测序结果与GenBank中收录的hTSHR全长序列一致,表明真核表达质粒构建正确.以脂质体转染COS-7细胞后,用RT-PCR和免疫细胞化学染色法检测表明,细胞可表达hTSHR.结论:成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR,为进一步研究TSHR的功能,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础.
