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呼吸机相关性肺损伤早期生物伤的发病机制探讨
目的 分析呼吸机相关性肺损伤(VILI)中生物伤的早期发病机制.方法 8周龄雄性SD大鼠24只,按随机数字表法分为假手术组(S组)、常规机械通气组(L组)和大潮气量(VT)机械通气组(H组),每组8只.麻醉大鼠后均行气管切开术,S组大鼠不进行机械通气、自主呼吸空气;L组和H组大鼠其他呼吸机参数均一致,吸入氧浓度(FiO2)为0.21,L组VT 7 mL/kg,H组VT 28 mL/kg.4 h后处死大鼠,取肺组织测定湿/干重(W/D)比值,苏木素-伊红(HE)染色后评估肺损伤程度,用原位末端缺刻标记法(TUNEL)染色后观察肺组织细胞凋亡情况,用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)测定肺组织中细胞膜半通道蛋白Pannexin-1的表达水平;提取支气管肺泡灌洗液(BALF),测定乳酸脱氢酶(LDH)、异前列醇和三磷酸腺苷(ATP)水平,并进行白细胞计数,用荧光染料Yo-pro-1/碘化丙啶(PI)双染后观察早期细胞凋亡情况.结果 S组与L组大鼠肺组织损伤情况差异无统计学意义.与S组和L组相比,H组大鼠肺组织出现明显的病理学损伤,表现为肺泡破裂、炎性细胞浸润、间质水肿、气道上皮脱落较明显,肺W/D比值明显增加(5.1±0.2比4.4±0.2、4.3±0.4,均P<0.01),病理学评分明显升高〔4.00(4.00,8.00)比1.00(0,4.00)、2.00(0,4.75),均P<0.01〕,BALF中白细胞数明显增加(×106/L:2.97±0.46比1.03±0.26、0.79±0.19,均P<0.01),LDH水平明显升高(U/L:148.6±38.2比34.4±13.5、78.6±13.9,均P<0.01),且肺组织中Pannexin-1蛋白表达水平明显升高(Pannexin-1/GAPDH:0.89±0.21比0.48±0.25、0.61±0.17,均P<0.01),BALF中ATP水平明显升高(nmol/L:456.84±148.72比19.23±13.34、113.26±57.90,均P<0.01);而3组间肺组织凋亡细胞数及BALF中细胞凋亡率、异前列醇水平差异无统计学意义〔肺组织细胞凋亡数(个/HP):4.00(3.00,5.00)比5.00(4.00,6.00)、4.00(3.25,6.00),BALF中细胞凋亡率:(0.57±0.20)％比(0.42±0.16)％、(0.58±0.19)％,BALF中异前列醇(μg/L):3.85±0.46比3.83±0.60、3.59±0.69,均P>0.05〕.结论 VILI中生物伤早期发病机制与膜通道感受压力应激开放并释放炎性介质有关,而凋亡、脂质过氧化反应不是首要致病因素.
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细胞膜半通道蛋白Pannexin-1对肺损伤小鼠肺组织P2X7受体活性的调控作用
目的 探讨细胞膜半通道蛋白Pannexin-1对肺损伤小鼠肺组织P2X7受体活化及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)介导的炎症反应的调控作用.方法 将60只雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为假手术(Sham)组、机械通气(MV)组、MV+低剂量脂多糖(LPS)组(MLL组)、MV+中高剂量LPS组(MML组)和MV+高剂量LPS组(MHL组),每组12只.应用大潮气量MV联合气道内注射LPS的方法制备小鼠双重打击肺损伤模型.所有小鼠均行气管切开插管,Sham组小鼠保持自主呼吸,其余4组均给予?28?mL/kg大潮气量MV.小鼠呼吸稳定后,Sham组和MV组经气道内注入生理盐水(NS)8?mL/kg,MLL组、MML组及MHL组分别给予2、5、8?mg/kg的LPS(以NS稀释成8?mL/kg).MV?4?h后处死小鼠,收集支气管肺泡灌洗液(BALF),测定细胞内外ATP浓度.取肺组织,测定肺含水率;苏木素-伊红(HE)染色后观察肺组织病理学改变,并进行肺损伤评分;采用免疫组化法观察肺组织中Pannexin-1的表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western?Blot)及荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肺组织中Pannexin-1、P2X7受体、caspase-1和白细胞介素-1β(IL-1β)的蛋白与mRNA表达.结果 Sham组小鼠肺组织无明显病理学改变;细胞内ATP浓度高于细胞外;肺组织含水率较低;免疫组化显示,肺组织中Pannexin-1呈低表达;且肺组织中Pannexin-1、P2X7受体、caspase-1及IL-1β均仅有微量蛋白或mRNA表达.与Sham组小鼠相比,MV组小鼠部分肺泡破损,渗出不明显,肺损伤评分略有升高;细胞内外ATP浓度无明显波动;肺组织含水率明显升高;肺组织中Pannexin-1、P2X7受体、caspase-1及IL-1β的表达略有升高.给予LPS干预后,小鼠肺组织渗出逐渐增多,肺泡破裂,肺泡壁毛细血管扩张,有炎性细胞趋化,肺损伤评分明显升高,但3个剂量组间无明显差异;随LPS剂量升高,小鼠BALF中细胞外ATP浓度呈递增趋势,细胞内ATP浓度呈递减趋势,肺组织含水率逐渐增高,肺组织中Pannexin-1、P2X7受体、caspase-1及IL-1β的蛋白和mRNA表达逐渐升高,均呈一定剂量依赖性.MHL组各项指标与MV组比较差异均有统计学意义〔肺损伤评分(分):8.25±0.45比3.50±0.52 ;细胞内ATP浓度(μmol/L):198.76±150.77比896.69±281.11,细胞外ATP浓度(μmol/L):336.57±90.28比141.52±42.22;肺组织含水率:(6.37±0.11)%比(5.05±0.14)% ;Pannexin-1蛋白(灰度值):3.20±0.70比1.54±0.76,Pannexin-1??mRNA(2-ΔΔCT):7.86±0.86比2.47±0.92;P2X7受体蛋白(灰度值):3.18±0.88比1.80±0.72,P2X7受体mRNA (2-ΔΔCT):7.17±0.96比2.31±0.45;caspase-1蛋白(灰度值):3.00±0.45比0.93±0.51,caspase-1?mRNA(2-ΔΔCT):?4.39±0.91比2.74±0.41;IL-1β蛋白(灰度值):2.54±1.08比1.16±0.53,IL-1β?mRNA(2-ΔΔCT):132.34±41.48?比19.67±8.67,均P＜0.05〕.结论 Pannexin-1在MV联合LPS诱导的肺损伤中,可能通过调节ATP由胞内释放到胞外,与细胞表面的P2X7受体结合,从而调控有活性的caspase-1生成和释放,参与IL-1β等炎性因子的生成,终导致肺损伤的发生发展.
关键词： 细胞膜半通道蛋白Pannexin-1 三磷酸腺苷 肺损伤 脂多糖 机械通气
