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头孢霉属真菌次生代谢产物研究进展
头孢霉(Cephalosporium Corda)系半知菌类(Fungi Imperfecti),丛梗孢目(Moniliales),丛梗孢科(Moniliaceae)中的一属真菌[1].头孢霉属真菌中的某些种,可产生具有抗革兰阳性和阴性细菌及抗癌活性的次生代谢产物,如产黄头孢霉、顶头孢霉等真菌可产生头孢菌素C.因此,对该属真菌次生代谢产物的研究,是国内外学者们的重要研究课题.
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非对称灭活原生质体融合法选育头孢菌素C高产菌株
目的 选育高产头孢菌素C产生菌.方法 分别以紫外线和加热灭活头孢菌素C产生菌Cephalosporium acremoniumu 18-U5和Cephalosporium acremoniumu 18-M6原生质体,并将两种灭活的原生质体经PEG4000融合,从融合株中筛选头孢菌素C高产菌株.结果 获得高产头孢菌素C的顶头孢霉融合株Cephalosporium acremoniumu F20,发酵单位达4 655 mg·L-1.与双亲菌株相比分别提高了42.4%和34.9%.结论 非对称灭活原生质体融合法选育头孢菌素C高产菌株的方法值得推广.
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顶头孢霉的去代谢产物反馈调节选育模型的建立与应用
目的建立头孢菌素C产生菌--顶头孢霉的去代谢产物反馈调节的高效筛选模型,筛选解除代谢产物反馈调节的突变菌株,提高头孢菌素C的发酵单位.方法使用NTG、UV、60Co连续诱变,结合使用终产物头孢菌素C梯度平板耐受及琼脂柱预筛选的方法进行筛选.结果应用此模型筛选出的高产菌株NUC-118,经摇瓶发酵及30 L发酵罐发酵,与出发菌株MNS-A8-51相比,头孢菌素C的发酵单位提高了25%.结论解除代谢产物头孢菌素C反馈调节的筛选模型是一种高效的筛选高产头孢菌素C突变菌株的筛选模型.
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顶头孢霉中过表达cefM对头孢菌素C产量的影响
由于头孢菌素类抗生素药物在临床上的重要性,除了对头孢菌素C (CPC)在顶头孢霉体内的生物合成途径及调控机制进行研究外,对其合成位置及相应的转运蛋白也进行了研究.基于此,本研究从顶头孢霉高产菌基因组DNA中扩增转运蛋白基因cefM序列,构建了一个cefM表达载体pYG283,将其导入顶头孢霉高产菌株中,挑选阳性转化子,并对其进行发酵培养,以观察CPC的产量.HPLC分析结果显示,转化子的CPC发酵水平均较出发菌高,其中产量高的1#转化子较出发菌提高20％.结果表明cefM在CPC生物合成中扮演着重要角色.
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顶头孢霉菌原生质体的制备和再生条件的优化
考察了细胞壁降解酶的种类、酶解时间、培养基种类和涂布方式对顶头孢霉原生质体制备和再生的影响,结果提示顶头孢霉菌丝形态对原生质的制备和再生也有重要影响.顶头孢霉生长过程可分为3个时期:细长时期、中度膨大时期和高度膨大时期.本试验利用显微图像分析法确定了各时期菌丝的形态参数,描述了培养过程中的菌丝形态变化规律,以及不同菌丝形态对原生质体释放和再生率的影响.终优化条件为:选择中度膨大初期的菌丝体,使用1％溶壁酶,30℃酶解2h后采用双层平板法接种于原生质体再生培养基Ⅰ(HCM)中.每1 ml原生质体悬浮液中原生质体的释放数可达2.51×108个,再生率大于20％.
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顶头孢霉中过表达AcveA提高头孢菌素C产量
与构巢曲霉veA基因同源的AcveA是近年来在顶头孢霉Acremonium chrysogenum中发现的一个全局性调控子,主要调控头孢菌素C (CPC)生物合成基因的转录水平.本研究通过从顶头孢霉高产菌基因组DNA中扩增AcveA序列构建了一个AcveA表达载体pYG280,将其导入顶头孢霉高产菌株中,荧光实时定量PCR检测阳性转化子中AcveA的相对转录水平,结果比出发菌株提高了165％.同时检测到AcveA基因导入后的转化子中CPC合成限速步骤中的早期基因pcbC、晚期基因cefEF以及cefG基因的mRNA转录水平分别较出发菌株提高了825％、353％和25％. HPLC分析结果显示,转化子CPC的发酵水平较出发菌株提高了22.7％.证明AcveA是CPC生物合成中的一个正向调控子.
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利用基因组改组技术改良7-ACA产生菌
将含假单胞菌(Pseudomonas)头孢菌素C(CPC)酰基转移酶基因ecs的pYG233质粒转入CPC产生菌顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)中,构建可发酵7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的基因工程菌(该菌株含有腐草霉素抗性标记phleo),为第一亲本.同时,构建含有潮霉素抗性标记(hgh)和ecs基因的重组质粒pYG236转化顶头孢霉菌株,以顶头孢霉(含有pYG236)作为第二亲本与第一亲本进行基因组改组,利用双重抗性标记作为融合子筛选条件,筛出一株7-ACA产量提高6.5倍的融合子工程菌.
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顶头孢霉蛋白质组的制备
分别采用液氮研磨-裂解酶破壁和尿素-硫脲结合三氯乙酸(TCA)-丙酮提取法,提取丝状真菌顶头孢霉Acremonium chrysogenum 84-3-87总蛋白,以SDS-PAGE和双向电泳检测比较两法的蛋白提取效果.结果显示,后法所获蛋白浓度高、条带多,双向电泳图像清晰,横条纹较少,拖带现象轻,可作为后续比较蛋白质组学研究的蛋白样本制备方法.
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头孢菌素C酰基转移酶在顶头孢霉中的表达
以假单胞菌的头孢菌素C(CPC)酰基转移酶为基础,根据顶头孢霉密码子偏爱性及RNA二级结构预测分析,设计并合成了全长2349 bp的CPC酰基转移酶基因ecs,并将其在大肠杆菌中表达.结果证明,表达蛋白能将CPC转化为7-ACA.将ecs表达质粒转化CPC产生菌顶头他霉,通过PCR、Southern blotting以及Western blotting等方法验证,表明ecs基因已成功整合到顶头孢霉染色体上并得到表达,重组菌的发酵也显示部分CPC直接转化成了7-ACA.
关键词： 顶头孢霉 头孢菌素C 7-氨基头孢烷酸 头孢菌素C酰基转移酶 -
基于参数相关分析的顶头孢霉新移种标准
以pH为在线过程参数,结合糖、铵的残留浓度等离线生化参数,分析顶头孢霉生长过程的代谢规律,并通过摇瓶实验确定了新的移种标准.照此标准进行了12m~3发酵罐验证试验.结果头孢菌素C的平均总亿比对照(旧移种标准)约提高了8%,同时杂质含量有所降低.
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顶头孢霉乙酰转移酶的可溶性表达优化和酶动力学
头孢菌素C生物合成途径中的后一步是将脱乙酰头孢菌素C在乙酰转移酶的作用下生成头孢菌素C.研究了重组脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶在大肠杆菌中可溶性表达的优化、提取纯化以及酶活的适反应条件,并测定了不同底物浓度下的大反应速度和米氏常数Km值.
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微波诱变头孢菌素C产生顶头孢霉菌的研究
本实验以头孢菌素C高产菌L32为出发菌株,通过微波诱变,得到变株L32-104,初复筛证明其发酵单位提高20%,且遗传性状非常稳定.该菌株在中试以及大生产中均获成功.实验表明微波诱变法操作简便、安全可靠、方法可行.
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采用接种体混合物培养顶头孢霉M25提高头孢C的产量
采用不同菌龄的接种混合物培养顶头孢霉M25,可提高头孢C的产量.早期与后期的接种体的比例为3:7时,得到CPC浓度的大值(2.17g/L).
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头孢菌素C高产菌株的推理选育
目的 优化推理选育条件,获得头孢菌素C高产菌株.方法 根据头孢菌素C的生物合成途径和代谢调控机制设计菌种推理选育方案,原始出发菌株经紫外诱变后,采用托盘琼脂柱筛选法依次对铜离子、丙二酸及头孢菌素C耐受菌株进行选育.结果 终获得一株头孢菌素C高产菌株TBC-68071,其产量较原始菌株提高了154.6％,且高产特性稳定.结论 对铜离子、丙二酸及头孢菌素C耐受的顶头孢霉菌株可以高产头孢菌素C,推理选育克服了随机筛选的盲目性,提高了菌种筛选的效率.
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顶头孢霉乙酰转移酶基因的克隆、表达和活性研究
头孢菌素C是工业上制备半合成β-内酰胺类抗生素的重要原料.头孢菌素C生物合成途径中的后一步是将脱乙酰头孢菌素C在乙酰转移酶的作用下形成头孢菌素C,编码催化这一步骤的乙酰转移酶的基因是cefG.由于cefG在染色体上具有内含子,通过RT-PCR的方法从头孢菌素产生菌顶头孢霉总RNA中获得了约1.1kb的cefG基因,将cefG基因克隆到大肠埃希菌质粒pET28a进行表达,SDS-PAGE电泳显示有明显的条带,体外活性测试表明表达产物能将脱乙酰头孢菌素C转化成头孢菌素C.
