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龟板提取物上调维生素D受体表达促骨髓间充质干细胞向成骨分化
目的 探讨龟板提取物诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向成骨分化和对维生素D受体(VDR)表达的影响.方法 从大鼠骨髓中分离MSCs.体外培养,利用流式细胞术检测MSCs表面抗原CD44细胞标志,体外培养MSCs分成不同的组观察其向成骨分化,在培养基中不加任何处理的作为对照组,培养基中加成骨诱导液诱导MSCs向成骨分化作为阳性对照组,龟板提取物组在培养基中加龟板提取物,诱导7 d后,通过免疫化学染色、Western blotting、原位杂交、RT-PCR等方法观察龟板提取物对原代培养的MSCs向成骨分化的成骨分化标记分子碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)及VDR阳性表达及VDR mRNA的表达情况.结果 免疫组化染色显示,龟板提取物组成骨分化标记分子ALP、OPN和VDR的阳性百分比明显高于对照组,Western blotting结果也显示龟板提取物组的ALP、OPN和VDR的蛋白表达水平高于对照组;同时原位杂交、RT-PCR结果表明.龟板提取物诱导MSCs向成骨分化过程可明显促进VDR mRNA的表达.结论 龟板提取物可促MSCs向成骨分化,其机制可能与VDR的上调有关.
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龟板提取物调控骨髓间充质干细胞中Id1表达的研究
目的 观察龟板提取物在不同的时间点对骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1的影响.方法 将构建成功的PGL3-Id1启动子用磷酸钙共沉淀法转染大鼠骨髓间充质干细胞,龟板提取物分别作用于转染后的骨髓间充质干细胞36小时、3天、7天,每个时间点分别加入0,1,3,30,100μg/ml的龟板提取物,药物作用一定时间后收集细胞分别应用萤光素酶报告基因系统、RT-PCR检测Id1蛋白的表达.结果 36小时和3天时,小剂量的龟板提取物对分化抑制蛋白1的影响不大,随着时间和剂量的增加,龟板提取物量效依赖性地促进了Id1的表达;7天时,龟板提取物对Id1的促进作用逐渐减弱.结论 龟板提取物促进了骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1的表达,且其促进作用呈现增高-强-减弱的特点.
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龟板提取物对PC12细胞凋亡的影响及其机制
目的:探讨龟板提取物(Plastrum testudinis Extracts,PTE)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及其机制.方法:采用无血清培养PC12细胞同时100 μmol/mL 6-OHDA损伤24 h的方法建立PC12细胞凋亡模型.细胞分为正常对照组、6-OHDA组及PTE3、30 μg/mL组四组.在施加处理因素24 h后,MTT比色分析测定细胞光密度值,Ammexin V/PI双染流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测BCL-X/L的表达水平.用Bio-Pad Quantity One凝胶分析系统对条带进行半定量分析.结果:MTT与流式细胞术结果显示PTE能提高PC12细胞活力,降低PC12细胞凋亡率,并呈剂量依赖性,PTE 3、30μg/mL组与模型组比较,差异具有统计学意义.Western blot结果显示龟板提取物使BCL-X/L表达增强,并呈剂量依赖性.结论:龟板提取物具有抑制6-羟基多巴胺诱导PC12细胞凋亡的作用,其作用机制可能与上调BCL-X/L的表达有关.
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龟板提取物调控Otx2基因促进神经干细胞向多巴胺神经元分化的研究
目的 探讨龟板提取物是否能够通过调控同源盒基因Otx2(orthodenticle homeobox 2)来促进神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向多巴胺神经元的分化.方法 分离培养孕14 d左右的SD胎鼠NSCs 7 d,随机设空白对照组和30μg·mL-1的龟板有效成分PTE(2B)组、 龟板提取物十八酸乙酯(S6)组、4-甾酮(S9)组,诱导分化5~7 d,用免疫荧光法检测多巴胺酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元和Otx2的表达,用实时荧光定量PCR法检测Otx2的mRNA表达,蛋白质印迹法(Western Blot)检测Otx2的蛋白表达.结果 与空白对照组比较,2B组、S6组和S9组Otx2和TH的荧光表达均升高(P<0.05),S6组Otx2的mRNA表达升高(P<0.05),S6组和S9组Otx2的蛋白表达升高(P<0.05).结论 龟板提取物可能通过调控Otx2基因促进神经干细胞向多巴胺神经元分化.
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龟板提取物对骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1表达的影响
目的 观察不同剂量的龟板提取物对骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1(inhibitor of differentiation 1,Id1)的作用.方法 将构建成功的PGL3-Id1启动子用磷酸钙共沉淀法转染大鼠骨髓间充质干细胞,龟板提取物分别作用于转染后的骨髓间充质干细胞12、24、36h,选取作用为明显的36h,每组分别加入0、1、3、30、100 μg/mL龟板提取物,药物作用36h后收集细胞分别应用萤光素酶报告基因系统、RT-PCR和Western blotting检测Id1的表达.结果 早期、小剂量龟板提取物对Id1的影响不大；随着时间和剂量的增加,Id1的表达水平也逐渐升高.结论 龟板提取物促进了骨髓间充质干细胞中Id1的表达,剂量越大,作用时间越长,促进作用越明显.
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维生素D调控龟板提取物促骨髓间充质干细胞增殖分化的研究
目的 观察维生素D(Vit D)调控龟板提取物(PTE)促进骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖过程的作用及其机制.方法 构建PGL3-Id1启动子,转染大鼠MSCs,PTE分别联合10-6、10-7、10-8 mol/L的Vit D作用于转染后的MSCs 36 h,利用荧光素酶检测MSCs中Id1启动子的水平.1、3、30、100 μg/mL PTE分别联合10-7 mol/L Vit D作用于MSCs 36 h、3d、7d,RT-PCR检测VDR的表达.结果 PTE促进了MSCs中Id1的表达,联合应用Vit D,Id1的表达会降低,这种差异具有极显著性统计学意义(P＜0.01),且不同剂量Vit D之间比较差异也有极显著性统计学意义(P＜0.01).药物联合作用36 h、3d和7d时,均不同程度抑制了VDR的表达;作用36 h时Vit D联合大剂量PTE时抑制作用显著,与不加PTE组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);而作用3d和7d时,Vit D联合大剂量PTE时抑制作用更为明显;不同剂量PTE联合Vit D作用相同时间,不同剂量之间VDR的表达量差异有统计学意义(P＜0.05),而相同剂量PTE联合Vit D作用不同时间,7d与36 h时VDR表达量比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Vit D抑制了PTE促MSCs的增殖作用,核受体VDR可能是PTE调控MSCs增殖和分化的一个药物作用靶点.
