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稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH-7细胞株的建立
目的：为研究细胞周期相关因子PAK2在原发性肝癌中的作用,拟用shRNA干扰技术建立稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH-7肝癌细胞系。方法用基因转染技术将人PAK2的3个shRNA片段分别克隆至慢病毒载体pHBLV-U6-ZsGreen-Puro,包装成病毒后利用脂质体将载体病毒转染至HUH-7细胞,利用G418筛选稳定表达shRNA的细胞。利用Real-time PCR和Western blotting方法分别鉴定转染细胞内PAK2的RNA及蛋白表达水平。结果 sh1-PAK2 HUH-7、sh2-PAK2 HUH-7和sh3-PAK2病毒载体均可转染至HUH-7细胞系,且转染效率较高(跃80%)。Real time-PCR结果显示,与对照组sh-cont比较,转染sh1-PAK2、sh2-PAK2和sh3-PAK可明显抑制HUH-7细胞内PAK2-mRNA的表达,差异均有统计学意义(均P<0.05),其中sh2-PAK2和sh3-PAK2的干扰效果尤为明显,下调效率分别达68%和89%。 Western blotting结果显示,转染sh3-PKA2细胞内PAK2的蛋白表达量较对照组sh-cont明显下调,其表达量为对照组sh-cont的14.4%。结论稳定抑制PAK2基因表达的肝癌细胞系shPAK2 HUH-7的建立为PAK2在肝癌细胞中的作用机制研究奠定细胞基础。
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miR-545-3p抑制食管癌细胞Eca109和TE-1生长的机制研究
目的 探讨miR-545-3p抑制食管癌细胞Eca109和TE-1生长的机制.方法 以食管癌细胞Eca109和TE-1作为研究对象,转染miR-NC(对照组)或miR-545-3p(实验组);荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)、细胞周期素D1 (Cyclin D1)和p21活化蛋白激酶2(PAK2) mRNA及蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化;细胞增殖实验(MTS法)和集落形成实验检测细胞增殖能力.结果 过表达miR-545-3p后,CDK4、Cyclin D1和PAK2 mRNA及蛋白的表达明显下调(P＜0.05),促进细胞周期的进展和细胞凋亡的增加(P＜0.05),明显抑制食管癌细胞的增殖能力(P＜0.05).结论miR-545-3p通过靶向干扰CDK4、Cyclin D1和PAK2的表达来抑制食管癌细胞的生长,是食管癌基因治疗的潜在靶点.
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RhoGDI2、PAK2在胃癌中的原位表达及与临床病理特征的相关性
目的 检测RhoGDI2、PAK2在胃癌患者中的表达状况,评价其与胃癌临床病理特征的相关性,评估RhoGDI2、PAK2在胃癌侵袭、转移中的临床意义.方法 采用免疫组织化学技术(EliviSionTM二步法)检测103例胃癌标本中RhoGDI2、PAK2的表达.结果 胃癌组织中RhoGDI2和PAK2蛋白表达阳性率分别为72.82％、60.19％;RhoGDI2和PAK2在胃癌中的表达与胃癌分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移个数、有无远处转移和TNM分期密切相关,RhoGDI2和PAK2的表达呈正相关.结论 胃癌组织中RhoGDI2、PAK2的表达与胃癌侵袭、转移病理特征密切相关.RhoGDI2与PAK2可能共同参与调节胃癌的侵袭、转移过程.
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PAK2:一种新的乳腺癌治疗预测标志物
[目的]研究PAK2 mRNA表达水平和乳腺癌病人预后之间的关系.[方法]利用在线数据库(包括ONCOMINE、乳腺癌基因表达Miner v4.0和Kaplan-Meier Plotter)的临床及表达谱数据集,评估分析PAK2在乳腺癌预后中的价值.[结果]与正常组织样本相比,乳腺癌组织PAK2 mRNA水平显著升高;在仅接受过辅助化疗的ER(+)、ER(-)乳腺癌患者中和仅接受三苯氧胺治疗的乳腺癌患者中,PAK2表达升高则无复发生存期(relapse-free survival,RFS)显著缩短;PAK2 mRNA水平与乳腺癌分子亚型相关,在不同分子亚型乳腺癌组织间表达水平不同.[结论]PAK2是一个潜在的乳腺癌化疗效果预测标志物.
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PAK2真核表达载体的构建及在胃癌细胞内的表达与定位
目的 构建PAK2真核表达载体及证实在胃癌细胞内的表达与定位.方法 提取HeLa细胞的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增PAK2全长编码基因,克隆至pcDNA3.1A表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,Western blot检测蛋白表达,免疫荧光检测PAK2在胃癌细胞内的定位.结果 hPAK2全长基因序列克隆到了真核表达载体pcDNA3.1A中,酶切鉴定片段为2 000 bp.Western blot检测到重组质粒蛋白表达,分子量约为75 kDa.免疫荧光检测pcDNA3.1A-PAK2在胃癌细胞内的定位以细胞浆为主,细胞核内少许.结论 成功构建hPAK2全长基因真核表达载体,重组质粒主要定位于胃癌细胞浆.
