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针对HP450基因shRNA真核表达载体的质粒转染
目的 以pGPH1/GFP/Neo质粒为载体,构建特异性针对HP450基因shRNA真核表达载体,并通过脂质体介导转染正常的大鼠肝细胞株(BRL),以探讨靶向干扰HP450基因对BRL细胞生长的影响.方法 构建pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体.应用脂质体转染技术,将重组的pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体转染至大鼠肝细胞株(BRL),并于转染后6、12、24 h在荧光倒置显微镜下观察细胞状态.结果 成功构建针对HP450基因shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,通过脂质体介导转染大鼠肝细胞株BRL,在荧光倒置显微镜下可观察到细胞转染后的荧光现象.结论 成功构建的HP450 shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,可通过质粒转染方法转染至BRL细胞.
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MAPKs抑制剂对大鼠肝细胞GSH代谢相关酶的影响
目的:观察丝裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)抑制剂对大鼠肝细胞谷胱甘肽(GSH)代谢的影响,确定哪条途径与GSH代谢相关.方法:体外培养BRL大鼠肝细胞,以c-Jun NH2-末端激酶(JNK)途径抑制剂SP600125、p38途径抑制剂SB203580、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)途径抑制剂PD98659处理24h,采用MTT法测定细胞活力,高效液相色谱法测定细胞内GSH含量,Luminex法测定JNK和磷酸化JNK(p-JNK)的蛋白表达,采用试剂盒测定GSH代谢酶活性.结果:SP600125浓度＞5μmol/L,SB203580浓度＞20 μmol/L,PD98659浓度＞40 μmol/L时,细胞活力受抑制;SP600125能显著减少大鼠肝细胞内还原型GSH的含量,SB203580和PD98659作用不明显;SP600125显著减少磷酸化JNK(p-JNK)蛋白表达,显著增强谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力.结论:JNK MAPK途径参与了大鼠肝细胞GSH的代谢.
