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HPLC/MS/MS法测定人血浆中内源性尿嘧啶及二氢尿嘧啶
目的为评价人体内二氢嘧啶脱氢酶的活性,建立高效液相色谱-串联质谱联用的分析方法,测定该酶的底物以及催化产物在血浆中的基础浓度.方法血浆样品液-液萃取后,以纯水为流动相,以Discovery Amide C16色谱柱初步分离, 经气动辅助电喷雾离子源负离子化,在三级四极杆质量分析器上以多反应离子监测(MRM)方式检测尿嘧啶(MRM m/z 111.0 → 41.9)和二氢尿嘧啶(MRM m/z 113.0 → 42.0) .结果尿嘧啶和二氢尿嘧啶的低定量浓度分别为0.5 ng*mL-1和5 ng*mL-1 ;线性范围分别为0.5-100 ng*mL-1和5-1 000 ng*mL-1, 精密度和准确度符合生物样品分析要求.结论此法专属、灵敏、准确,适用于测定生物样本中内源性尿嘧啶和二氢尿嘧啶的基础浓度.
关键词： 尿嘧啶 二氢尿嘧啶 HPLC/MS/MS 血浆 -
内源性尿嘧啶类物质比值在5-氟尿嘧啶化疗中毒性预测价值的临床研究
目的:评价内源性二氢尿嘧啶(UH2)与尿嘧啶(U)的比值(RUH2U)在5-氟尿嘧啶(5-Fu)化疗方案中与5-氟尿嘧啶血药浓度(C5FU)、消化系统毒性级别的相关关系,为5-氟尿嘧啶化疗方案的调整及剂量个体化提供依据.方法:对20例以5-氟尿嘧啶化疗的鼻咽癌病人,化疗前测定RUH2/U,化疗中测定5-氟尿嘧啶血药浓度,化疗后评价5-氟尿嘧啶毒性并进行相关分析.结果:RCH2/C 与CsHU、5-氟尿嘧啶致腹泻、口腔粘膜毒性均具显著相关性.结论:RUH2/C值大小可作为评价5-氟尿嘧啶临床用药的依据应用于疗效及毒性的预测.
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内源性尿嘧啶和二氢尿嘧啶的简易高效液相色谱测定法
目的:建立测定内源性嘧啶类物质尿嘧啶(U)及二氢尿嘧啶(HU2)的反相高效液相色谱法,并应用于癌症病人5-氟尿嘧啶(5-Fu)化疗前的嘧啶代谢缺陷及毒性预测.方法:色谱柱:大连依利特ODS2(250mm×4.6mm,5μm).以5-Fu作内标,经沉淀蛋白并以异丙醇与乙酸混合液提取,进行色谱分析.流动相为0.01mol.L-1KH2PO4-H3PO4缓冲液（pH=3.0），流速0.5ml.min-1,检测波长204nm.xf js :UH2的线性方程为Y=136.70X-9.42(r=0.9909,n=7)U的线性方程为Y=78.05X+1.03(r=0.9993,n=7),线性浓度范围为8μg.L-1～500μg.L-1,UH2低检测浓度为6μg.L-1,U低检测浓度为4μg.L-1.平均回收率UH2为66.6%,U为70.4%.结论:本方法在同一色谱条件下完全分离二种痕量内源性嘧啶类物质,并予以定量分析,结果可作为确定行5-氟尿嘧啶化疗方案的肿瘤病人个体化给药剂量的依据.
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HPLC法测定血浆中尿嘧啶和二氢尿嘧啶的含量
目的:建立人血浆中内源性尿嘧啶(U)和二氢尿嘧啶(UH2)的HPLC测定方法,为通过UH2/U比值评价体内二氢嘧啶脱氢酶活性提供方法学基础.方法:采用Shim-pack CLC-ODS柱(6 mm×150 mm,5μm),以0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值为4.0)为流动相,测定U的检测波长为260 nm,测定UH2的检测波长205 nm.以含3%牛血清白蛋白(BSA)的水溶液配制标准样品和质控样品.以溴尿嘧啶为内标,采用叔丁基甲醚/正丙醇(75:25)为提取溶剂进行两次提取,氮气吹干、复溶后进样分析.结果:U在5～200 μg·L-1的范围内线性良好(r=0.999 5,n=6),测定的批内变异RSD在1.73%～3.45%之间,批间变异RSD在1.76%～2.53%之间,回收率为96.15%～105.09%;UH2在10～400 μg·L-1的范围内线性良好(r=0.999 6,n=6),测定的批内变异RSD在3.67%～3.80%之间,批间变异RSD在3.40%～5.74%之间,回收率为101.51%～104.06%.结论:本方法灵敏度高,操作简便易行,为测定体内尿嘧啶和二氢尿嘧啶,进而评价二氢嘧啶脱氢酶活性提供方法学基础.
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口腔癌患者内源性二氢尿嘧啶与尿嘧啶血浆浓度比值在5-Fu化疗中的应用价值
目的:探讨口腔癌患者内源性二氢尿嘧啶(UH2)与尿嘧啶(U)血浆浓度的比值及其在5-Fu化疗中的应用价值.方法:36例口腔癌患者术后给予DDP+5-Fu辅助化疗,化疗前采用高效液相色谱法检测患者血浆中UH2和U的比值(RUH2/U),并根据RUH2/U调整5-Fu的给药剂量,化疗中检测5-Fu的血药浓度并观察其毒副作用.结果:口腔癌患者RUH2/U值为2.31±1.06(0.61～5.18),其中2例RUH2/U比值低于1.0;RUH2/U值男女间存在显著性差异,而各年龄段间无显著性差异;5-Fu的给药剂量范围为0.89～3.09g/m2,患者5-Fu的血药浓度为318.96±150.62μg/L,所有患者均未出现严重的毒副作用.结论:RUH2/U大小可用于调整5-Fu的剂量,以达到5-Fu的个体化化疗.
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肿瘤患者血浆内源性二氢尿嘧啶及尿嘧啶的测定
目的测定肿瘤患者血浆中的二氢尿嘧啶(H2U)与尿嘧啶(U)的比值来间接估计二氢尿嘧啶脱氢酶(DPD)的活性.方法采用HPLC法测定肿瘤患者血浆中内源性物质H2U和U的比值.色谱柱:反相C1s柱(300mm×4.6 mm,5 μm);流动相:0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH3.0),5 μmol·L-1磷酸三乙胺;检测波长204 nm.结果 202例肿瘤患者入选,其H2U/U为(2.50±1.25)(0.53～7.51),男性为(2.58±0.85),女性为(2.41±0.98);有50例的H2U/U低于2.0,其中男性患者为29例,女性为21例.DPD酶活性与年龄、性别不存在相关性(P>0.05).结论通过HPLC法测定血浆DPD酶活性来调节氟尿嘧啶的剂量,从而达到个体化给药的目的.
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非小细胞肺癌患者外周血二氢嘧啶脱氢酶活性测定
目的 探讨非小细胞肺癌患者血二氢嘧啶脱氢酶(DPD)活性值及与非小细胞肺癌患者临床病理参数相关关系.方法 应用高效液相色谱法(HPLC)测定41例非小细胞肺癌患者血内源性二氢尿嘧啶(H2U)与尿嘧啶(U)的比值来判断外周血DPD的活性,并分析DPD的活性与非小细胞肺癌患者各临床病理参数是否具有相关性.结果 41例非小细胞肺癌患者血DPD活性为3.75±1.92,小为1.59,大为6.07,呈正态分布；其与患者性别、年龄、部位、病理类型、临床分期等临床病理参数均无相关性.结论 外周血DPD活性与非小细胞肺癌患者的各临床病理参数无相关性,因此可以认为外周血DPD活性目前难于作为独立指标预测非小细胞肺癌患者的预后,但可以作为预测5-Fu为主化疗疗效及不良反应的简便方法.
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反相高效液相色谱法测定肿瘤患者血清中的二氢尿嘧啶和尿嘧啶
目的 建立肿瘤患者血清中二氢尿嘧啶和尿嘧啶浓度测定方法.方法 应用反相高效液相色谱法,流动相为磷酸盐缓冲溶液(含0.48%三乙胺),流速0.7 mL/min,检测波长206 nm.结果 二氢尿嘧啶低检测限8μg/L,尿嘧啶低检测限为5μg/L.血清中二氢尿嘧啶和尿嘧啶质量浓度为15.63～500μg/L时,与相应值线性关系良好(r≥0.9959).血清中二氢尿嘧啶和尿嘧啶回收率分别为74.56%～88.67%和83.95%～69.54%.结论 该方法精密度高、简单、快捷.
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内源性二氢尿嘧啶与尿嘧啶比值在5-Fu化疗中毒性关系的临床研究
目的 评价内源性二氢尿嘧啶(UH2)与尿嘧啶(U)比值在5-Fu化疗中消化系统毒性的关系,为5-Fu在恶性肿瘤中的个体化治疗提供一种理论依据.方法 70例恶性肿瘤患者,大肠癌48例,鼻咽癌21例,食管癌1例,化疗前采用高效液相色谱法测定UH2与U的值,比值≥2.05为正常.结果 UH2/U值正常者53例,发生Ⅰ～Ⅱ度恶心呕吐、腹泻和口腔粘膜炎分别为35、26和17例;UH2/U 值＜2.05者17例,各有7例患者出现Ⅰ～Ⅱ度恶心呕吐和腹泻,9例患者出现口腔粘膜炎,发生Ⅲ～Ⅳ度反应分别为9、9、7例,两者间有显著性差异(P＜0.05).增加用药剂量和改变用药方式,口腔粘膜炎和腹泻的发生率不同,差异具有显著性.结论 化疗前测定UH2/U 值可预测5-Fu的化疗毒性,并为个体化治疗提供依据.
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高效液相色谱法测定人血浆中内源性尿嘧啶二氢尿嘧啶含量
目的:建立准确测定内源性尿嘧啶和二氢尿嘧啶血药浓度的高效液相色谱法.方法:以氟尿嘧啶(5-FU)为内标,醋酸乙酯-异丙醇混合液(85:15)为提取溶剂;色谱柱Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 靘);流动相A-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液(pH 5.5),B-乙腈,梯度洗脱;流速为0.8 mL·min-1;柱温为4 ℃;检测波长为204 nm(0～14.5 min),254 nm(14.5～35 min).结果:尿嘧啶和二氢尿嘧啶线性范围为8～500 靏稬-1,线性回归方程分别为C(UH2)=61.760 8Y+0.506 5,r=0.999 8;C(U)=95.201 1Y-3.064 0,r=0.999 3,(n=7).低检测质量浓度均为5 靏稬-1.尿嘧啶方法回收率为99.3%～107.0%,二氢尿嘧啶方法回收率为95.0%～98.3%.尿嘧啶日内RSD小于6.5%,日阍RSD小于11.7%,二氢尿嘧啶目内RSD小于9.2%,日间RSD小于12.4%.结论:本方法可用于内源性尿嘧啶和二氢尿嘧啶血药浓度的常规监测.
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二氢嘧啶脱氢酶活性替代值在结直肠癌化疗中个体化给药的应用
目的:在氟尿嘧啶(5-FU)+醛氢叶酸(CF)结直肠癌化疗方案中,测定二氢嘧啶脱氢酶(DPD)活性替代值并评价与5-FU血药浓度及毒性级别的相关性.方法:以高效液相色谱法测定结直肠癌患者体内内源性嘧啶类物质二氢尿嘧啶(UH2)与尿嘧啶(U)的比值,作为DPD活性的替代值,同时行连续5 d的5-FU+CF辅助化疗方案,第5天监测5-FU血药浓度,评价DPD酶活性替代值与5-FU血药浓度及毒性的相关性.结果:50例结直肠癌患者行5-FU+CF辅助化疗方案,化疗前测定DPD酶活性替代值为(4.2±1.2),5-FU的血药浓度为(2 203.6±612.4)μg·L-1,DPD酶活性替代值与5-FU血药浓度、5-FU毒性级别呈负相关.结论:血中DPD酶活性替代值(UH2/U值)的测定可作为5-FU结直肠癌化疗时的血药浓度及毒性的预测指标,修正5-FU按体表面积的给药方式,为结直肠癌5-FU化疗个体化剂量的确定提供更为可靠的理论依据.
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二氢嘧啶脱氢酶活性与结直肠癌患者5-FU辅助化疗毒性关系的研究
背景与目的:5-氟尿嘧啶(5-FU)应用于不同的患者中,它的毒性及疗效均不同,个体差异较大.现发现二氢嘧啶脱氢酶(Dihydropyrimidine dehydrogenase,DPD)在其中起重要作用.本研究测定结直肠癌患者血DPD活性,并评价其与结直肠癌患者5-FU辅助化疗毒性及5-FU血药浓度之间的关系.方法:入选符合标准的结直肠癌患者30例,术前采用高效液相色谱法(HPLC)法测定血内源性二氢尿嘧啶(UH2)/尿嘧啶(U)值代表血DPD活性,术后2周行甲酰四氢叶酸(CF)60 mg/m2,2 h静脉滴注,5-FU 425 mg/m2,2 h静脉滴注,连续5天方案,辅助化疗.第1天刚滴完5-FU时和第5天刚滴完5-FU时抽血查5-FU血药浓度.评价患者血DPD活性和患者5-FU化疗毒性及其与5-FU血药浓度之间的相关性.结果:30例结直肠癌患者行5-FU/CF方案辅助化疗.化疗前查血DPD活性为4.09±1.21,低2.14,高6.7,呈正态分布,个体差异较大.第1天刚滴完5-FU时5-FU血药浓度为(2079.12±621.41)μg/L(1200.10～3554.80 μg/L);第5天刚滴完5-FU时5-FU血药浓度为(2197.64±606.78)μg/L(1259.00～3441.03μg/L),亦呈正态分布,个体差异较大.Pearson相关分析显示,血DPD活性与第1天刚滴完5-FU时5-FU血药浓度(r=-0.773,P=0.00)及第5天刚滴完5-FU时5-FU血药浓度(r=-0.833,P=0.00)呈负相关.t检验显示第1天刚滴完5-FU时5-FU血药浓度及第5天刚滴完5-FU时5-FU血药浓度没有差异(P=0.458).Spearman相关分析统计显示,5-FU致恶心呕吐、腹泻、骨髓抑制级别与血DPD活性呈负相关,与5-FU血药浓度呈正相关(P＜0.05).结论:检测血DPD活性可以推断5-FU化疗时5-FU血药浓度及预测5-FU化疗的毒性,为结直肠癌的个体化治疗提供了理论依据.
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以反相离子对HPLC法同时测定大鼠内源性尿嘧啶和二氢尿嘧啶
目的 建立测定血清中内源性嘧啶类物质尿嘧啶(U)及二氢尿嘧啶(UH2)的反相离子对HPLC方法.方法 :实验动物血清用5%高氯酸一步沉淀蛋白,分离并通过微孔滤膜后进样.色谱柱为迪马C18色谱柱(250 mm×4.6 mm),柱温10℃;流动相为含磷酸根0.03 mol/L.、含庚烷磺酸钠O.03 mol/L及含6%甲醇的缓冲液(pH=3.0),流速0.5 ml/min.检测波长210 nm,灵敏度为0.1AUFS.结果 本文色谱条件可很好地分离尿嘧啶(U)及二氢尿嘧啶(UH2).测定10只不同年龄不同性别来自不同实验动物中心的动物具有不同的U/UH2比值.结论 以反相离子对HPLC法可精密测定大鼠内源性尿嘧啶和二氢尿嘧啶的比值.
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HPLC法间接测定肿瘤患者外周血中二氢尿嘧啶脱氢酶的活性
目的:建立间接测定肿瘤患者外周血中二氢尿嘧啶脱氢酶(DPD)活性的方法.方法:采用高效液相色谱(HPLC)法测定肿瘤患者血浆中内源性物质二氢尿嘧啶(H2U)和尿嘧啶(U)的比值,间接估算DPD的活性.其中,色谱柱为Xterra RPC18,流动相为甲醇-0.02 mol·L-1磷酸二氢钠(pH4.0)(5:95),流速为1.0 mL· min-1,检测波长分别为204 nm(H2U)、260 nm(U).结果:H2U、U检测浓度分别在62.5～2 000 μg·L-1(r=0.999 7)、15.625～500 μg·L-1(r=0.999 3)范围内线性关系良好,日内RSD分别≤7.7％、8.3％,日间RSD分别≤13.8％、13.4％,方法回收率分别为99.63％～103.02％、98.38％～109.08％.63例肿瘤患者的DPD活性(H2U/U比值)在肿瘤患者中变异较大,范围为1.51～6.67.结论:本方法可用于肿瘤患者外周血DPD活性的常规监测.
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HPLC法间接测定肿瘤患者外周血DPD的活性
目的 建立高效液相色谱法(HPLC)间接测定肿瘤患者外周血二氢尿嘧啶脱氢酶(DPD)活性的方法.方法 采用HPLC法测定肿瘤患者血浆中内源性物质二氢尿嘧啶(H2U)和尿嘧啶(U)的比值,间接估算DPD的活性.色谱柱:Xterra RPC18 (250 mm×4.6 mm,5μm)；流动相:甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钠(pH4.0),比例为5∶95;流速为1.0 mL/min,H2U和U检测波长分别为204 nm、260 nm.结果 H2U线性范围为62.5 ～2 000μg/L,线性方程为:Y=7.48×10 -4X+ 1.24×10-1,r=0.999 7(n=6),批内RSD小于7.7％,批间RSD小于13.8％,方法学回收率为99.63％ ～ 103.02％;U线性范围为15.625 - 500 μg/L,线性方程为:Y=3.42×10-3X+2.58×10-2,r=0.999 3(n=6),批内RSD小于8.3％,批间RSD小于13.4％,方法学回收率为98.38％～109.08％.结论 本方法可用于肿瘤患者外周血DPD活性的常规监测.
