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用Red重组系统快速敲除大肠杆菌aroL和aroK基因
目的:利用Red重组系统构建aroL和aroK缺失的大肠杆菌工程菌株.方法:本研究应用PCR扩增两翼与目的基因上下游同源的、含有氯霉素抗性基因片段,电击转化大肠杆菌BW25113.在阿拉伯糖诱导下,含有质粒pKD46的菌株DH5α表达λ噬菌体的3个重组蛋白,利用含同源臂的氯霉素抗性片段分别替换目的基因aroK和aroL,并进一步利用FTP位点专一性重组将氯霉素抗性基因删除.结果:成功地敲除了aroK和aroL基因.结论:莽草酸是一种具有极高价值的精细化工产品和医药中间体,具有广泛的医药、化工应用价值.莽草酸是莽草酸途径中的重要中间产物,它在莽草酸激酶(aroK和aroL)的作用下流向3-磷酸莽草酸,阻碍了莽草酸在大肠杆菌体内的堆积.敲除上述基因将为使用大肠杆菌发酵生产莽草酸奠定基础.
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肠出血性大肠杆菌z5150毒素基因在细胞黏附过程中的作用
目的 通过体内过度表达验证z5150基因毒性,利用Red重组系统构建肠出血性大肠杆菌(EHEC)z5150基因缺失突变株并探究其致病力.方法 在菌体内过度表达z5150基因,测定细菌生长曲线验证其毒性.应用PCR技术扩增出含有卡那霉素抗性基因的目的基因上下游同源臂片段,电转入含有pKD46质粒的EHEC中,在阿拉伯糖诱导下使打靶片段重组到基因组.卡那霉素基因的两端包含FRT位点,pFLP2质粒可介导FLP位点专一性重组去除抗性标记.经DNA测序验证目的基因缺失后,通过菌株感染HT29细胞和BALB/c雌鼠检测缺失株细胞黏附能力和毒力的改变.结果与结论 成功构建EHEC△z5150缺失突变株.z5150的缺失不影响细菌的正常生长,但过度表达后明显抑制细菌生长,发挥毒素效应.与野生株相比,EHEC△z5150缺失突变株对肠上皮细胞黏附能力明显增强;小鼠致死率增高,提示其致病力增强.该研究为EHEC基因功能研究提供了基因敲除技术,证明了RelE家族z5150参与EHEC细胞黏附,并增强菌株毒力,为进一步研究EHEC致病机制奠定了基础.
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用Red系统快速敲除痢疾杆菌asd基因
目的:用Red系统快速敲除痢疾杆菌asd基因.方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5′端与asd基因同源,3′端与氯霉素抗性基因同源),并用来获得氯霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌DH5α和痢疾杆菌福氏2a 2457T中,在λRed重组系统的帮助下,通过氯霉素抗性基因两侧的asd基因序列在体内与asd基因发生同源重组,置换了DH5α和2457T基因组中的asd基因,后又利用氯霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FTP位点专一性重组将氯霉素抗性基因剔除.结果与结论:获得了asd基因被完全敲除且不带氯霉素抗性基因的大肠杆菌和痢疾杆菌,使Red系统在大肠杆菌以外微生物中的应用获得成功.
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肠出血性大肠杆菌O157:H7 z0986-z1444双缺失突变株构建
目的 采用Red重组方法敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 z0986和z1444基因,构建双缺失突变株.方法 首先构建z0986、z1444打靶片段;其次以电击法转化感受态细胞,之后通过PCR鉴定所得菌株;终所得阳性单克隆测定生长曲线.结果 z1444单基因缺失突变株(Δz1444/933)及z0986-z1444双基因缺失突变株(Δz0986/Δz1444/933)构建成功,其生长曲线与野生型EHEC O157:H7差异均无统计学意义.结论 z0986与z1444基因缺失对EHEC的生长无影响.构建Δz1444/933及Δz0986/Δz1444/933为深入研究z1444基因的功能及作用机制奠定了基础.
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肠出血性大肠杆菌z4832基因缺失突变株的构建
目的 利用Red重组系统的同源重组功能,敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7 (EHEC O157∶H7)的乙酰转移酶基因z4832,构建z4832基因缺失突变株.方法 EHECO157∶H7的基因组作为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列;将上下游同源臂连接于pUC19-kana质粒上卡那霉素(kana)抗性基因的两端;PCR扩增获得中间嵌合卡那霉素抗性基因的同源臂线性片段,利用质粒pKD46介导的重组技术敲除z4832基因,利用pCP20质粒介导的重组技术去除抗性标记.PCR扩增及DNA测序验证目的基因缺失后,测定突变株及野生株的生长曲线,检测在抗菌药物氧氟沙星中的存活率.结果 成功构建EHEC O157∶H7 z4832基因缺失突变株.z4832缺失突变株生长速度与野生株差异无统计学意义,但在含氧氟沙星的LB培养基中突变株存活率升高(P＜0.05),在含氧氟沙星的M9培养基中存活率下降(P＜0.05).结论 构建z4832缺失突变株,研究z4832与肠出血性大肠杆菌耐药性之间的关系,为进一步研究乙酰转移酶在EHEC O157∶H7中的作用机制奠定了基础.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 Red重组系统 乙酰转移酶 抗生素 -
采用Red重组系统敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因
目的 敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,获得无弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌菌株.方法 采用PCR从pKD46质粒上扩增λ噬菌体的Red重组酶基因,并将其克隆到大肠杆菌和铜绿假单胞菌穿梭质粒pUCP多克隆位点上,电击转化铜绿假单胞菌PAO1感受态细胞,构建PAO1/pUCP-Red基因敲除体系.常规基因操作构建两端与弹性蛋白酶基因上、下游同源,中间为庆大霉素抗性基因的线性打靶片段;并将其电击转化pUCP-Red/PAO1感受态;采用庆大霉素和羧苄青霉素抗性平板初步筛选阳性重组菌;通过PCR、RT-PCR及弹性蛋白酶活性检测方法,鉴定菌株弹性蛋白酶基因的敲除情况.结果 本研究通过构建Red重组系统,获得了无弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌菌株.结论 本研究成功敲除了铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,所获无弹性蛋白酶活性的菌株将为系统深入研究弹性蛋白酶在铜绿假单胞菌致病性中的详细作用机理提供材料和基础.
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肠出血型大肠埃希菌O157：H7 ppk基因缺失株的构建及其生物学特性分析
目的：利用Red重组系统构建肠出血型大肠埃希菌（EHEC）O157：H7 ppk基因缺失株,并研究其生物特性。方法设计并合成一对同源臂引物，每条引物5'端与ppk基因同源，3'端与卡那霉素抗性基因同源，扩增卡那霉素抗性基因片段；制备含有pKD46质粒的EHEC O157：H7 EDL933w感受态细菌，然后将该抗性基因片段电击转化入制备的感受态菌株中；利用pKD46介导的Red重组系统，通过同源重组替换EHEC O157：H7 EDL933w ppk基因，PCR和测序验证；通过革兰染色、测D600值、吉姆萨染色比较EHEC O157：H7 EDL933w野生株和突变株的形态结构、生长能力和黏附性。结果构建了ppk基因缺失并含有卡那霉素抗性的EHEC O157：H7 EDL933w突变菌株（EHEC O157：H7 EDL933wΔppk），初步探索了EHEC O157：H7 EDL933w野生株和突变株的生物学特性。结论本研究运用Red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157：H7 ppk基因缺失株，为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中ppk基因的调控机制奠定了基础。
关键词： EHEC O157:H7 ppk基因 Red重组系统 基因突变 -
大肠埃希菌 sdiA 基因缺失株的建立
目的：为研究 HSL信号分子对大肠埃希氏菌的影响而建立大肠埃希菌 sdiA基因缺失株。方法通过Red重组系统敲除大肠杆菌BW25113和SM10λpir的 sdiA基因，PCR测序鉴定；不同时间点检测A600值，绘制细菌生长曲线；荧光定量PCR检测csgD、csgB基因水平。结果 PCR测序结果经DNAman软件比对分析，与预想结果一致；与野生株相比，sdiA基因突变对细菌生长曲线无明显影响。结论成功建立BW25113、SM10λpir的 sdiA基因缺失株，为后续研究铜绿假单胞菌信号分子 HSL对大肠埃希菌的影响奠定了基础。
