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肠出血性大肠杆菌z5150毒素基因在细胞黏附过程中的作用
目的 通过体内过度表达验证z5150基因毒性,利用Red重组系统构建肠出血性大肠杆菌(EHEC)z5150基因缺失突变株并探究其致病力.方法 在菌体内过度表达z5150基因,测定细菌生长曲线验证其毒性.应用PCR技术扩增出含有卡那霉素抗性基因的目的基因上下游同源臂片段,电转入含有pKD46质粒的EHEC中,在阿拉伯糖诱导下使打靶片段重组到基因组.卡那霉素基因的两端包含FRT位点,pFLP2质粒可介导FLP位点专一性重组去除抗性标记.经DNA测序验证目的基因缺失后,通过菌株感染HT29细胞和BALB/c雌鼠检测缺失株细胞黏附能力和毒力的改变.结果与结论 成功构建EHEC△z5150缺失突变株.z5150的缺失不影响细菌的正常生长,但过度表达后明显抑制细菌生长,发挥毒素效应.与野生株相比,EHEC△z5150缺失突变株对肠上皮细胞黏附能力明显增强;小鼠致死率增高,提示其致病力增强.该研究为EHEC基因功能研究提供了基因敲除技术,证明了RelE家族z5150参与EHEC细胞黏附,并增强菌株毒力,为进一步研究EHEC致病机制奠定了基础.
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结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞的生长抑制作用
目的 探索结核分枝杆菌RelE毒素蛋白是否对肺癌A-549细胞有生长抑制作用.方法 采用PCR技术克隆结核分枝杆菌RelE、RelB、RelBE基因,分别构建真核质粒PcDNA3.1-RelE、PcDNA3.1-RelB和PcDNA3.1-RelBE.经酶切分析和DNA测序证实重组质粒构建成功后,采用脂质体转染方法分别转入肺癌A-549细胞,经RT-PCR鉴定后,建立稳定表达相关蛋白的细胞株.通过细胞生长曲线、活细胞蛋白含量测定、MTT细胞增殖实验、HE染色观察细胞凋亡、流式细胞术检测瞬时转染细胞的凋亡率等,观察结核分枝杆菌RelE毒素蛋白是否对肺癌A-549细胞具有生长抑制和促凋亡的作用.结果 结核分枝杆菌RelE毒素蛋白组的肺癌A-549细胞增殖速度低于其他各组,对营养缺乏更为敏感,相同范围视野下凋亡细胞多于其他各组,瞬时转染细胞的凋亡率也高于其他组(P<0.05).结论 结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞具有生长抑制和促凋亡的作用.
