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人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达
目的:从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因,构建其真核表达质粒,并在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中进行表达.方法:从HepG2中提取总RNA,采取逆转录PCR(RT-PCR)方法得到人LDLR的cDNA.将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中,进行酶切和序列鉴定.将重组质粒pcDNA3-hLDLR和空载体转入Hepa1-6,G418筛选,并用RT-PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达.结果:人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3-hLDLR,双酶切和测序表明,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性,但编码的氨基酸序列完全一致,该序列的GenBank登录号为gi|21629647|gb|AY114155.1,并且真核表达质粒的构建正确.用脂质体介导的方法转入Hepa1-6后,用RT-PCR和FACS检测表明,细胞可表达人LDLR.结论:成功地构建了真核表达质粒pcDNA3-hLDLR,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础.
关键词： 低密度脂蛋白受体(LDLR) 克隆 基因表达 Hepa1-6细胞 质粒 -
PCSK9单抗生物学活性测定方法的建立
目的:建立前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)单抗的生物学活性检测方法.方法:利用系列稀释的PCSK9单抗以剂量依赖性方式阻断PCSK9与低密度脂蛋白受体(LDLR)结合,增加低密度脂蛋白(LDL)在HepG2细胞内摄取率,通过BODIPY类荧光染料标记低密度脂蛋白(BODIPY-LDL)检测胞内荧光强度来反映PCSK9单抗的生物学活性,并用PCSK9单抗参比品计算供试品相对百分效价.结果:PCSK9、PC-SK9单抗参比品及供试品在该方法中均存在量效关系,且符合四参数方程式:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D.利用该法对4批PCSK9单抗供试品进行检测,每批供试品重复试验3次,PCSK9单抗的相对百分效价的平均值在94.25％ ～ 110.77％之间,变异系数均小于15％.结论:该方法灵敏度高、重复性好、结果准确,可作为PCSK9单抗生物学活性测定的常规检测方法.
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额尔敦-乌日勒对AS家兔肝低密度脂蛋白受体(RDLR)表达的影响
目的:观察额尔敦-乌日勒对实验性动脉粥样硬化家兔肝脏低密度脂蛋白受体(LDLR)表达的影响.方法:采用喂饲高脂饲料建立家兔AS模型,将60只家兔随机分为正常对照组,模型组,额尔敦-乌日勒高、中、低剂量组和辛伐他汀组.实验结束后,采用实时定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)方法检测肝脏LDLR mRNA的表达.结果:与模型组比较,额尔敦-乌日勒高、中剂量组肝脏LDLR mRNA的表达明显升高(P＜0.05).结论:额尔敦-乌日勒可升高肝脏LDLR的表达,从而起到抗动脉粥硬化作用.
关键词： 额尔敦-乌日勒 动脉粥样硬化 低密度脂蛋白受体(LDLR) -
家族性高胆固醇血症(FH)致病基因的研究进展
家族性高胆固醇血症( familial hypercholesterolemia,FH)的临床特征为血总胆固醇升高,尤其是低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-c)升高,沉积于组织,形成皮肤或肌腱黄色瘤,导致动脉粥样硬化甚至早发冠心病.FH的发病机制为LDL受体(LDL receptor,LDLR)或apoB基因突变引起LDL受体途径功能缺陷,主要为常染色体显性遗传疾患,具有基因剂量效应；部分患者为常染色体隐性遗传,机制为LDL受体衔接蛋白1(LDL receptor adaptor protein 1,LDLRAP1)失功能型突变,导致LDL内化活性降低.罕见的人类枯草溶菌素转化酶9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)发生功能型突变也可引起严重的FH表型.PCSK9通过降解LDLR蛋白间接下调LDL受体途径,其失功能突变可致血浆LDL水平下降.因此PCSK9是目前降脂药物的研究热点.
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补肾益气方对流产大鼠胎盘孕酮生成通路的影响
目的:探讨补肾益气方对流产大鼠胎盘孕酮生成通路中相关重要上游因素低密度脂蛋白受体(LDLR)、细胞色素P450链裂解酶(P450scc)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)的影响及其与孕酮(P)分泌的关系.方法:溴隐亭皮内注射法建立流产大鼠模型,分别于孕1-8 d、1-11 d灌服补肾益气方药,黄体酮肌注作为阳性对照组,采用放免法测定大鼠血清P水平;RT-PCR技术检测LDLR、P450scc、3β-HSD在不同组动物胎盘中的mRNA表达.结果:模型组LDLR、P450scc、3β-HSDmRNA表达较正常对照组明显降低;中药组及黄体酮组不同程度提高模型大鼠胎盘LDLR、P450scc、3β-HSD mRNA表达,表达强度随孕天和给药时间逐渐升高,与血P有显著相关性.结论:补肾益气方清热益气、固肾安胎,能调控胎盘滋养细胞LDLR、P450scc、3β-HSD基因表达,促进孕激素合成分泌增加,从而达到保胎维持妊娠的目的.
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胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外人滋养层细胞孕酮分泌的影响
目的:探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)对人早孕绒毛滋养层细胞孕酮(P)的合成和调节作用.方法:将胰蛋白酶和胶原酶联合消化人早孕绒毛滋养组织,Percoll密度梯度分离纯化后得到的人早孕胎盘滋养层细胞进行原代培养.以终浓度为0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L IGF-I分别对其作用1 2 h,以及1 00μg/L浓度IGF-Ⅰ作用12 h、24 h、48 h、72 h时,放免法检测滋养细胞分泌P的含量,RT-PCR法检测低密度脂蛋白受体(LDLR)mRNA的表达.结果:滋养层细胞P的分泌量随着IGF-Ⅰ的浓度升高而增加;同时100 μg/L浓度的IGF-Ⅰ作用于滋养层细胞1 2 h后,P分泌开始增加,48 h达到高峰,以后逐渐下降.半定量RT-PCR均显示LDLR mRNA阳性条带,且表达规律与P一致.结论:滋养层细胞P的分泌具有对IGF-Ⅰ的时间和浓度依赖性,并且IGF-Ⅰ能上调LDLR mRNA的表达,对促进滋养细胞P分泌的调节起重要作用.
