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抑制差减杂交筛选大鼠烧伤后差异表达基因
目前,抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)因其简单易行和假阳性率低成为研究基因表达变化的重要实验方法[1].我们尝试用SSH分析烧伤大鼠外周血淋巴细胞及单核细胞基因表达的变化,为全面了解严重烧伤后早期该类细胞的功能改变打下基础.1 材料与方法1.1 主要仪器和材料雄性SD大鼠由第二军医大学动物中心提供.PCR仪为PE2400型,凝胶图像分析仪为GDS8000型.Trizol总RNA提取试剂盒及PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜生物技术公司;PolyATract
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氡染毒小鼠肺及支气管组织的基因表达
目的 构建氡染毒小鼠肺及支气管组织差异表达基因的cDNA文库,并对其进行初步鉴定和同源性分析.方法 采用SR-NIM02型氡室对小鼠进行吸入染毒后,常规饲养3个月,分别提取和纯化染毒组(30工作水平月,WLM)与对照组(0.02 WLM)小鼠的肺及支气管组织的总RNA,采用Super SMART技术和抑制性差减杂交技术(SSH),构建氡染毒后肺及支气管组织的正、反向差减杂交的cDNA文库;常规连接pGEM-T-easy载体,转化DH5α感受态细胞,巢式PCR鉴定;对阳性克隆测序,并与GeneBank数据库进行BLAST同源性比对,进行初步功能分类.结果 共获得克隆460个,其中含有插入片段的克隆146个,经BLAST同源性比对后有48个正向差减cDNA片段与61个反向差减cDNA片段与GeneBank中的序列有不同程度的同源性.结论 成功构建了氡染毒小鼠肺支气管差异表达cDNA文库,染毒后小鼠肺及支气管组织中某些基因会发生差异表达,其中部分基因可能参与细胞凋亡和周期调控、机体免疫调节及细胞间信号传导等过程.
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抑制差减杂交筛选辐射致癌差异表达基因
目的筛选研究辐射诱发小鼠肿瘤相关差异表达基因.方法以60Co γ射线照射诱发的小鼠白血病动物模型为研究对象,采用抑制差减杂交技术构建辐射致癌差异表达基因cDNA文库,鉴定后挑取阳性克隆测序,并与GeneBank数据库进行同源性比对分析.结果抑制差减杂交筛选得到102个阳性克隆,随机挑选30个克隆进行菌液PCR,扩增得到28个特异性插入片段,DNA测序结果经与GeneBank数据库比对发现代表了24个已知基因,其中3个为重复检出基因,暂未发现有未知序列基因.结论成功建立辐射致癌差异表达基因cDNA文库,初步筛选获得24条表达上调的差异片段,该结果将有助于充实完善辐射致癌的分子机制.
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肝癌乙型肝炎病毒X抗原相关基因的克隆
目的观察HepG2细胞因乙型肝炎病毒X抗原(HBx)转染导致的基因表达差异。方法①用逆转录病毒感染的方法建立表达乙型肝炎病毒X抗原(HepG2X)及氯霉素乙酰转移酶(HepG2Cat)的细胞模型。②用抑制差减杂交的方法做HepG2X和对照细胞(HepG2Cat)的cDNA文库差示筛选。③用32P随机引物标记法标记探针做Northern Blot杂交及地高辛缺口翻译标记法做原位分子杂交以筛选基因探针。结果经cDNA文库差减杂交及抑制性PCR扩增共得到10个cDNA探针，其中8个被HBx所启动，2个因HBx而表达下降。经检测，这些基因在HepG2X和对照细胞中的表达均有差异。在被HBx所抑制的2个差示表达基因中，1个与人的蛋白翻译起始因子同源，同时发现，此基因在正常组织中表达较强，而在肿瘤组织中表达被抑制。结论 HBx能够改变宿主细胞的基因表达，并且这些基因变化可能和肝癌发生有关。
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抑制差减杂交方法筛选辐射诱导细胞恶性转化模型中的差异表达基因
目的:筛选辐射诱导的支气管上皮细胞恶性转化模型中的差异表达基因.方法:应用抑制差减杂交方法(SSH)构建辐射诱导的细胞转化模型差异表达基因的cDNA文库.对差减文库进行PCR筛选,对得到的差异片段进行测序及BLAST分析;对部分筛选出来的差异表达基因使用荧光定量PCR方法检测并确认其变化;将新的序列表达标签(EST)登录到GenBank上.结果:在80个进行测序的克隆中,得到确定序列的共73个.在转化细胞中表达下降的序列41条,BLAST比较分析结果:得到已知序列6条;未知基因的EST序列20条;空载体序列7条;8条为重复测定序列.在转化细胞中表达上升的序列32条,BLAST分析:已知序列14条;未知基因的EST序列9条;重复测定的序列9条.对其中的部分基因改变进行荧光定量PCR检测,结果表明辐射转化组中MY06、HACE1、ZNF143、HNRPH1的表达量明显增加(与对照组相比,转化组中的mRNA分别增加了3.49、29.38、12.99、5.00倍);而PCBP2、RPL15、TCERG1的表达量下降(与对照组相比,转化组中的mRNA分别减少了1.89、48.77、11.95倍).将得到的29个未知序列登录到GenBank,序列ID:EB643220～EB643248.结论:利用抑制差减杂交方法成功建立了恶性转化细胞模型差异表达cDNA文库,包含大量功能未知的新基因;ZNF143表达增加,其与细胞的增殖与分裂有关,TCERG1作为转录辅助激活因子在mRNA转录和后期的修饰过程中起到重要的作用,PCBP2是一个Polyc连接蛋白,具有蛋白翻译调节功能,这些基因在辐射致癌中尚无研究报道.
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抑制差减杂交技术筛选幽门螺杆菌对甲硝唑耐药相关DNA片段
目的筛选幽门螺杆菌(Hp)临床分离菌株对甲硝唑耐药的相关DNA片段.方法从浙江大学医学院附属邵逸夫医院消化内科就诊患者胃粘膜活检标本中分离培养Hp.采用二倍平皿稀释法确定Hp菌株对甲硝唑的耐药性.分别选取敏感菌和耐药菌各1株,提取其基因组DNA,采用抑制差减杂交技术分别以其中1株作为被检菌,另1株作为参考菌进行基因组差异研究.结果73.8%(31/42)临床分离的Hp菌株对甲硝唑耐药.耐药株共检出10余个大小约在200～1000bp的特异性DNA片段.结论通过抑制差减杂交技术可筛选出耐药株和敏感株各自特异的DNA片段.
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嗜人按蚊雌蚊消减cDNA文库的构建及分析
目的 构建嗜人按蚊雌雄蚊差异表达cDNA文库.为进一步筛选、克隆嗜人按蚊雌雄蚊差异新基因奠定基础.方法 以嗜人按蚊为实验模型,分别将雌蚊和雄蚊作为T组和D组.采用抑制消减杂交方法和T/A克隆技术构建嗜人按蚊差异表达cDNA文库.扩增正向消减cDNA文库获得3 000余个阳性克隆,随机挑取100个克隆进行PCR扩增,90%的克隆中均有200～1 000bp的插入片段.溯序显示.有与冈比亚按蚊未知功能基因同源的克隆,去除重复序列,得到72个EST序列,其中40与巴知序列具有相似性,32个为新的EST序列.本项研究成功构建了嗜人按蚊雌蚊差异表达cDNA文库,获得了32个新的EST序列,从而为下一步筛选、克隆嗜人按蚊性别差异新基因打下了基础.
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与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库构建
目的 构建与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库,为进一步筛选、克隆按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵差异新基因奠定基础.方法 以大劣按蚊-约氏疟原虫为实验模型,分别将饱吸约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后14 d的大劣按蚊作为T 组和D 组,采用抑制差减杂交方法和T/ A克隆技术构建按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关cDNA 文库.结果 扩增差减cDNA文库获得2 670个阳性克隆,随机挑取克隆测序显示有与冈比亚按蚊未知功能基因同源的克隆.结论 成功构建与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库.
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骨桥蛋白在人胆囊腺癌中的表达
目的 应用抑制差减杂交联合cDNA芯片技术筛选人胆囊腺癌组织中差异表达基因,进一步探讨筛选出的骨桥蛋白在胆囊腺癌中的表达及作用.方法 胆囊腺癌组织和非肿瘤组织作为对比材料进行抑制差减杂交,构建正、反向差减杂交文库,应用差减片断的PCR产物制备cDNA芯片,筛选胆囊腺癌组织中差异表达基因.采用实时荧光定量技术和免疫组化方法验证和分析筛选出的胆囊腺癌中高表达基因骨桥蛋白在胆囊腺癌和正常胆囊组织中的转录水平和蛋白水平的表达.结果 成功构建了胆囊腺癌差减文库.cDNA芯片杂交结果显示骨桥蛋白在胆囊腺癌中高表达,经实时荧光定量技术证实.免疫组化结果表明骨桥蛋白在胆囊腺癌和癌旁胆囊组织中高表达,在正常胆囊组织中低表达(P＜0.05),其表达部位主要在细胞核,在低分化胆囊腺癌中骨桥蛋白的表达有增高趋势.结论 抑制差减杂交方法构建的胆囊腺癌差减杂交文库富含胆囊腺癌差异表达基因.胆囊腺癌中高表达基因骨桥蛋白可能与胆囊细胞的生长、转移和侵袭能力有关.
