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免疫荧光法检测全反式维甲酸和As2O3对人口腔鳞状细胞癌KB细胞的诱导分化作用
目的 研究细胞角蛋白(cytokeratin,CK)13在口腔鳞状细胞癌中表达的变化规律,探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)与三氧化二砷(As2O3)在诱导分化人口腔未分化鳞状细胞癌细胞系KB细胞中的作用.方法 采用免疫荧光标记CK-13单克隆抗体及KB细胞细胞核,检测CK-13在ATBA与As2O3诱导分化KB细胞前后的表达变化.将同期培养的KB细胞分为对照组(细胞培养液)、ATRA实验组及As2O3实验组.培养72 h后分别观察3个视野下对照组与实验组KB细胞中CK-13在细胞质中的表达情况,并统计胞质着色率.结果 免疫荧光检测法发现对照组的KB细胞中CK-13绿色荧光染色胞质着色率为(1.00±0.58)%;ATRA实验组的3个浓度组中CK-13绿色荧光染色胞质着色率分别为(100.00±0.00)%、(100.00±0.00)%、(98.96±1.04)%,而As2O3实验组的3个浓度组结果 分别为(100.00±0.00)%、(100.00±0.00)%、(88.64±11.36)%.对照组与实验组CK-13绿色荧光染色胞质着色率的统计数据对比差异均有统计学意义(P＜0.05),各实验组之间相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ATRA与As2O3对KB细胞均存在诱导分化作用,CK-13定位着色于细胞质,其表达变化与肿瘤细胞分化程度呈正相关,可作为评估ATBA和As2O3对OSCC诱导分化疗效的分子标志物.
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反义角蛋白13慢病毒质粒对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响
目的 探讨反义角蛋白13(Keratin-13,KRT13)慢病毒质粒对鼻咽癌HNE-1细胞放射敏感性的影响.方法 构建稳定表达反义KRT13基因的慢病毒质粒,并通过G418筛选出稳定转染该质粒的鼻咽癌HNE-1细胞.按数字随机法将细胞分为control(正常HNE-1细胞)组、lentivirus(转染慢病毒空载体)组和anti-KRT 13(转染慢病毒质粒组).并分别检测各组细胞中KPT13含量.同时采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化.在0、1、2、4、6、8Gy6个放射剂量点下,采用克隆形成实验分析转染反义KRT13基因对细胞的存活影响,并分别用单击多靶模型和线性二次模型拟合出细胞的剂量存活曲线,对比放射生物学参数D0、Dq、N值、α、β和SF2值,评价细胞放射敏感性的变化.结果 转染慢病毒质粒组的HNE-1细胞D0、Dq、N和SF2值较其他两组均增加,α/β值减小,且差异具有统计学意义(P均＜0.05);反义KRT13可以阻滞细胞于G2/M期,同时抑制细胞凋亡.结论 反义KRT13慢病毒质粒可降低鼻咽癌HNE-1的放疗敏感性.
关键词： 角蛋白13 反义慢病毒 鼻咽癌HNE-1细胞 放射敏感性 -
CK13基因5′旁侧活性与其组织特异性表达的相关性研究
目的检测CK13基因5′旁侧在不同细胞中的报告基因活性,探讨CK13基因组织特异性表达及上皮性肿瘤中异常表达与CK13基因5'旁侧活性的关系.方法采用报告基因分析的方法,构建CK13基因5'旁侧513bp与氯霉素乙酰转移酶报告基因载体pCAT-Enhancer的重组体,并通过脂质体介导的转染技术导入不同细胞,检测该重组体报告基因的瞬间表达,探讨CK13基因5'旁侧报告基因载体在不同细胞中的活性.同时采用Northern-blot的方法检测这些细胞中CK13基因的表达情况,探讨CK13基因组织特异性表达与其5'旁侧活性的关系.结果不同类型细胞中的CK13基因5'旁侧报告基因活性不一,报告基因活性很低的细胞不表达CK13基因,报告基因活性很强的细胞明显表达CK13基因.结论 CK13基因组织特异性表达及上皮性肿瘤中异常表达与CK13基因5'旁侧活性明显相关.
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Jarid1b对食管鳞癌KYSE-150细胞增殖及分化的影响
目的 研究去甲基化酶Jarid1b对食管鳞癌细胞增殖及分化的影响,为食管鳞癌治疗提供新的靶点.方法 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)以及Western-blot方法检测低分化食管鳞癌细胞系KYSE-150和高分化食管鳞癌细胞系TE-1中去甲基化酶Jarid1b、细胞角蛋白10(CK10)、细胞角蛋白13(CK13)的表达.采用慢病毒转染的方式获得能够在药物诱导时过表达Jarid1b的KYSE-150稳转细胞系,应用CCK8细胞毒性实验检测过表达Jarid1b对该细胞系增殖能力的影响;采用RT-qPCR和Western-blot方法检测过表达Jarid1b后细胞系CK10和CK13表达量的变化.结果 RT-qPCR检测结果表明,和低分化KYSE-150细胞系相比,高分化TE 1细胞系中CK10和CK13高表达(t=22.07、38.44,P＜0.05);Western-blot检测结果表明,和KYSE-150细胞系相比,TE-1细胞系中Jarid1b的蛋白表达水平明显增高.CCK8实验结果显示,与未诱导的KYSE-150细胞系相比,诱导KYSE-150细胞系过表达Jarid1b 24、48 h后,该细胞的增殖能力明显下降(t=10.94、16.71,P＜0.05).RT-qPCR和Western-blot方法检测结果表明,诱导KYSE-150细胞系过表达Jarid1b以后,与未诱导的KYSE-150细胞系相比CK10和CK13的表达明显增高(t=9.706、5.23,P＜0.05).结论 去甲基化酶Jarid1b过表达可以抑制低分化食管鳞癌细胞KYSE-150的增殖并促进其分化.
