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密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼症模型角膜和泪腺组织的保护作用
目的 探讨密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼症动物模型角膜及泪腺组织的保护作用与炎症反应的关系.方法 150只健康1月龄Wistar雄性大鼠随机分为5组(正常组、假手术组、手术对照组、雄激素治疗组、密蒙花总黄酮治疗组,分别用A、B、C、D、E组表示),每组30只.A组不作处理;B组只切开阴囊,不切除睾丸.作为假手术对照组;C、D、E三组实验鼠切除双侧睾丸及附睾.自造模后1周,待伤口基本愈合开始用药.A、B、C组以生理盐水灌胃,1次/天;D组用丙酸睾酮注射液大腿肌肉注射,1次/3天;E组以密蒙花提取物生理盐水混悬液灌胃,1次/天.各组实验动物分别于用药1、3、5个月后随机取10只,行SchirmerI试验(SIT)、泪膜破裂时间(break-up,BUT)及角膜荧光素染色检查并处死各组动物,取双眼泪腺、角膜组织进行光镜和透射电镜观察.结果 SIT、BUT、角膜荧光素染色:A、B组这3项指标无明显变化(P〉0.05);C、D、E组去势治疗1个月,角膜荧光素染色、SIT、BUT各段时间差异均无统计学意义(P>0.05);C组3个月起角膜荧光素染色阳性.且随实验时间延长而加重;5个月起泪液浸湿滤纸长度较实验前短、BUT明显低于正常对照组,且随观察时间的延长而缩短,差异有统计学意义(P<0.05);D、E组于去势3、5个月后,角膜荧光素染色点较C组减少,SIT、BUT明显高于C组,差异有统计学意义(P<0.05);D、E两组间3个月后,SIT、BUT及角膜荧光素染色差异无统计学意义(P＞0.05);D、E两组间5个月后,差异有统计学意义(P<0.05).角膜和泪腺结构:A与B各组结构均无明显改变;C组自1个月起结构开始改变,且随时间延长逐渐加重;D、E两组间结构改变较C组相比明显减轻.结论 密蒙花总黄酮能减轻去势雄鼠逐渐加重的泪腺分泌功能损害和角膜上皮缺失并减轻其局部炎症反应,对干眼症模型角膜和泪腺有一定的保护作用.
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密蒙花总黄酮对去势雄鼠角膜组织Fas、 FasL表达的影响
目的 观察密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼病大鼠模型基础泪液分泌量、泪膜稳定性和角膜组织中凋亡相关蛋白Fas、FasL表达的影响,探讨密蒙花总黄酮抗性激素水平失调导致的大鼠干眼病的作用机制.方法 1月龄健康雄性Wistar大鼠150只,采用随机数字表法分为5组,每组30只,分别为:A组:正常组;B组:假手术组;C组:手术对照组;D组:雄激素治疗组(肌肉注射丙酸睾酮);E组:密蒙花总黄酮治疗组(密蒙花总黄酮灌胃给药);将C组、D组、E组实验鼠切除双侧睾丸及附睾以制作干眼病模型;B组只切开阴囊而不切除睾丸,作为假手术组;A组不做任何处理.各组在造模后1周,待伤口基本愈合后开始用药.各组实验动物分别于用药1个月、3个月、5个月后随机取10只,行Schirmer Ⅰ试验、测量泪膜破裂时间,然后处死各组动物,取双眼角膜组织用免疫组织化学的方法检测Fas、FasL蛋白的表达情况.结果 用药后5个月,D组、E组Schirmer Ⅰ试验测量值分别为(5.41±1.32)mm和(5.32±0.95)mm,均明显高于C组的(3.71±0.91)mm(均为P＜0.05);泪膜破裂时间分别为(9.34±0.87)s和(9.03±0.98)s,均明显长于C组的(7.78±1.07)s(均为P＜0.05).用药5个月后角膜组织中Fas蛋白光密度值在D组、E组分别为0.388±0.042和0.400±0.045,均明显低于C组的0.618±0.067(均为P＜0.05);角膜组织中FasL蛋白光密度值在D组、E组分别为0.379±0.015和0.417±0.028,均明显低于C组的0.680±0.038(均为P＜0.05).D组、E组间各指标差异均无统计学意义(均为P＞0.05).结论 密蒙花总黄酮可减少角膜组织中Fas和FasL的表达,抑制细胞凋亡,产生同丙酸睾酮治疗干眼病相似的效果.角膜细胞凋亡是雄激素缺乏导致干眼病的机制之一,且凋亡相关蛋白Fas和FasL的表达增加是导致角膜细胞凋亡的原因之一.
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密蒙花总黄酮对去势导致干眼症雄鼠泪腺Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表达的影响
目的 观察密蒙花总黄酮对雄激素水平下降所致干眼症雄鼠的泪腺上皮细胞中Bax Mrna、Bcl-2 Mrna表达的影响.方法 将健康1月龄、体质量150～180 g Wistar雄性大鼠150只随机分为A1、B1、C1、D1、E1、A3、B3、C3、D3、E3、A5、B5、C5、D5、E5共15组,每组10只.采用去势的方法建立雄激素水平下降所致干眼症动物模型,分别观察各组Schimer Ⅰ试验、泪膜破裂时间及角膜荧光素染色情况,以确定干眼症模型是否建立成功.其中,A代表正常组;B代表假手术组;C代表模型对照组;D代表雄激素对照治疗组(造模成功后,丙酸睾酮1 mg·kg-1大腿肌肉注射,每3 d 1次);E代表密蒙花总黄酮治疗组(造模成功后,密蒙花总黄酮0.045 g·kg-1灌胃,每3 d 1次);1代表饲养1个月;3代表饲养5个月;5代表饲养7个月.用RT-PCR法对各组泪腺组织中Bax Mrna、Bel-2 Mrna的表达进行检测,并比较.结果 Sclaimer Ⅰ试验、泪膜破裂时间及角膜荧光素染色结果显示,大鼠均在造模3个月后形成干眼症.D3组、D5组泪腺组织中的Bax Mrna相对含量较C3组、C5组降低,差异均有统计学意义(均为P<0.01);E3组、E5组较C3组、C5组亦降低,差异亦均有统计学意义(均为P<0.01);且E3组(3.787±0.165)与E5组(5.707±0.411)Bax Mrna相对含量差异有统计学意义(P<0.01);D5组(4.610±0.481)与E5组间比较差异亦有统计学意义(P<0.01).D3组、D5组Bcl-2 Mrna的相对含量较C3组、C5组增加,差异均有统计学意义(均为P<0.01);E3组、E5组较C3组、C5组亦增加,差异均有统计学意义(均为P<0.01);D5组(5.713±0.339)与E5组(3.147±0.057)间比较Bcl-2 Mrna表达差异有统计学意义(P<0.01);且E3组(8.427±0.055)与E5组比较差异亦有统计学意义(P<0.01).结论 密蒙花总黄酮可使大鼠泪腺中Bcl-2 Mrna表达增加,降低Bax Mrna的表达,但随病程的延长其作用弱于雄激素.密蒙花总黄酮治疗雄激素水平下降所致干眼症的机制可能与其产生拟雄激素效应后,对凋亡相关基因Bcl-2 mRvNA表达的上调和Bax mrRNA表达的下调有关.
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密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼症泪腺TGF-β1及其基因表达的影响
目的 观察密蒙花总黄酮对去势雄鼠导致干眼症泪腺TGF-β1及其基因表达的影响.方法 90只健康1月龄SPF级Wistar雄性大鼠切除双侧睾丸及附睾建立干眼症模型;30只匹配大鼠切开阴囊而不切除睾丸作为假手术组.手术1周后,雄激素治疗组用丙酸睾酮注射液1mg/kg股四头肌内注射,每3日1次(30只模型鼠);密蒙花总黄酮治疗组以密蒙花总黄酮0.02g/kg与生理盐水混悬液灌胃,每日1次(30只模型鼠);正常组(30只正常鼠)、假手术组、模型组(30只)以生理盐水灌胃,每日1次.造模1、3、5个月后各组随机抽取10只大鼠处死,取双眼泪腺组织免疫组织化学法检测TGF-β1的表达,采用实时定量PCR(real-time PCR)法荧光定量检测TGF-β1mRNA的表达.结果 造模5个月后,正常组和假手术组大鼠泪腺组织细胞中几乎无TGF-β1阳性表达,而模型组、雄激素治疗组和密蒙花总黄酮治疗组大鼠泪腺组织细胞中TGF-β1大量阳性表达,表现为大量棕黄色颗粒沉着.正常组、假手术组大鼠泪腺组织细胞中TGF-β1的平均光密度值(OD)高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05);密蒙花总黄酮治疗组和雄激素治疗组大鼠泪腺组织细胞中TGF-β1的平均OD值大于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05);密蒙花总黄酮治疗组的大鼠泪腺组织细胞中TGF-β1的平均OD值小于雄激素治疗组,差异有统计学意义(P＜0.05).TGF-β1 mRNA在不同组大鼠泪腺组织细胞中的表达差异比较与TGF-β1表达相同(P＜0.05).结论 密蒙花总黄酮可抑制去势雄鼠干眼症泪腺炎症反应,上调TGF-β1mRNA的表达以增加TGF-β1的合成是其作用途径之一.
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密蒙花总黄酮对去势导致干眼症雄鼠血清LH的影响
目的 观察密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼症大鼠模型基础泪液分泌量、泪膜稳定性及血清黄体生成素水平的影响.方法 将1 月龄健康雄性Wistar 大鼠150 只,随机分为正常组(A 组)、假手术组(B 组)、手术对照组(C 组)、雄激素治疗组(D 组)、密蒙花总黄酮治疗组(E 组);C、D、E 组采用去势的方法建立动物模型,各组在造模后1 周开始用药.各组实验动物分别于用药1、3、5 个月后随机取10 只,行Schirmer I 试验、测量泪膜破裂时间,于第5 个月,抽血测定血清黄体生成素水平.结果D、E 组Schirmer I 试验测量值明显高于C 组(P＜0.05)、泪膜破裂时间明显长于C 组(P＜0.05)、血清黄体生成素水平明显低于C 组(P＜0.0l).结论雄激素水平下降可导致干眼病,采用双侧睾丸及附睾切除的方法可成功建立雄激素水平下降所致的大鼠干眼病动物模型;密蒙花总黄酮具有拟雄激素效应,能够产生同丙酸睾酮治疗干眼病相似的效果.
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密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼症泪腺组织中白细胞介素-1β表达的影响
目的 观察密蒙花总黄酮对去势导致干眼症雄鼠泪腺组织中白细胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)表达的影响.方法 健康1个月Wistar雄性大鼠随机分为正常组、假手术对照组、模型组、雄激素组、密蒙花总黄酮组,造模后1、3、5个月3个不同时间段处死,观察泪腺组织中IL-1β表达的病理形态学改变,并用免疫组织化学方法检测泪腺组织中IL-1β表达.结果 正常组、假手术对照组、丙酸睾酮组、密蒙花总黄酮组IL-1β表达显著低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；正常组、假手术对照组的IL-1β表达显著低于丙酸睾酮组、密蒙花总黄酮组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 密蒙花总黄酮通过抑制去势干眼症雄鼠泪腺组织中IL-1β的表达,进而抑制干眼症泪腺的炎症反应.
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密蒙花总黄酮含药血浆对干眼症细胞模型Bax mRNA及Bcl-2mRNA表达的影响
目的:观察密蒙花总黄酮含药血浆对干眼症细胞模型中泪腺上皮细胞Bax mRNA及Bcl-2 mRNA表达的影响.方法:将培养生长状态良好的泪腺上皮细胞,随机分为无雄激素培养黄酮治疗组(以下简称密蒙花总黄酮组),含雄激素培养对照组(以下简称雄激素组),无雄激素培养空白组(以下简称空白组).分别加入含密蒙花总黄酮血浆、丙酸睾酮、含空白血浆开始进行干预.建立干眼症细胞模型.用Trizol试剂提取细胞总RNA.RT-PCR法检测泪腺上皮细胞中Bax mRNA及Bcl-2 mRNA的表达.结果:密蒙花组、雄激素组能够抑制泪腺上皮细胞中Bax mRNA的表达,与空白组比较差异有显著性(P＜0.01);密蒙花组Bax mRNA的表达低于雄激素组,比较差异有显著性(P＜0.01).密蒙花组、雄激素组Bcl-2 mRNA的表达均高于空白组,比较差异有显著性(P＜0.01);密蒙花组Bcl-2 mRNA的表达高于雄激素组,比较差异有显著性(P＜0.01).结论:密蒙花总黄酮含药血浆作用于雄激素水平下降所致干眼症的细胞模型可抑制Bax mRNA的表达,使Bax mRNA的表达量降低,同时促进Bcl-2 mRNA的表达,使Bcl-2 mRNA的表达量增加.密蒙花总黄酮含药血浆很可能是通过抑制泪腺上皮细胞中Bax mRNA及促进Bcl-2 mRNA表达的途径而达到抑制细胞凋亡的作用.
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密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼症模型角膜和泪腺组织中TNF-α,IL-1β表达的影响
目的:探讨密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼症动物模型角膜及泪腺组织炎症因子表达的影响与组织损伤的关系.方法:选取150只健康1月龄Wistar雄性大鼠随机分为5组(正常组、假手术组、手术对照组、雄激素治疗组、密蒙花总黄酮治疗组,分别用A,B,C,D,E组表示),每组30只.将C,D,E三组实验鼠切除双侧睾丸及附睾;B组只切开阴囊,不切除睾丸,作为假手术对照组,A组不作处理.自造模后1wk,待伤口基本愈合开始用药.A,B,C组以生理盐水灌胃,1次/d;D组用丙酸睾酮注射液大腿肌肉注射, 3d 1次;E组以密蒙花提取物生理盐水混悬液灌胃,1次/d.各组实验动物分别于用药1,3,5mo后随机取10只,行Schirmer Ⅰ试验、泪膜破裂时间(break-up time, BUT)及角膜荧光素染色检查并处死各组动物,取双眼泪腺、角膜组织采用免疫组织化学方法观察各组角膜和泪腺组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)蛋白的表达. 结果:A与B组泪腺、角膜上皮细胞中TNF-α,IL-1β阳性表达均不明显;C组泪腺、角膜上皮细胞中TNF-α,IL-1β阳性表达的细胞数明显高于D,E组(P<0.05);D,E各组间差异不显著(P>0.05).结论:去势雄鼠干眼症角膜和泪腺组织局部炎症反应可能是角膜损伤和泪腺分泌功能丧失的原因之一,TNF-α,IL-1β表达增加与其炎症反应有关.密蒙花总黄酮能够下调去势雄鼠角膜和泪腺局部TNF-α,IL-1β蛋白的表达,可能是其治疗干眼症的关键机制之一.
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密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼病血清睾酮水平的影响
目的：观察密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼病大鼠模型基础泪液分泌量、泪膜稳定性及血清睾酮水平的影响，探讨密蒙花总黄酮抗性激素水平失调导致的大鼠干眼病的作用机制。方法：将1月龄健康雄性Wistar大鼠150只，体质量200 g左右，采用随机数字法分为5组，每组30只。分别为：A：正常组；B：假手术组；C：手术对照组；D：雄激素治疗组；E代表：密蒙花总黄酮治疗组；将C， D， E三组实验鼠切除双侧睾丸及附睾；B组只切开阴囊而不切除睾丸，作为假手术组；A组不做任何处理。各组在造模后1 wk ，待伤口基本愈合后开始用药。各组实验动物分别于用药1，3，5mo后随机取10只，行Schirmer Ⅰ试验（ SⅠt）、测量泪膜破裂时间（breaking up time，BUT），于第5mo，抽血测定血清睾酮水平。结果：D，E组SⅠt测量值明显高于C组（ P＜0．05）、BUT明显长于C组（P＜0．05），血清睾酮水平C，E组明显低于A，B，D组（P＜0．0l）。结论：雄激素水平下降可导致干眼病，采用双侧睾丸及附睾切除的方法可成功建立雄激素水平下降所致的大鼠干眼病动物模型。密蒙花总黄酮具有拟雄激素效应，能够产生同丙酸睾酮治疗干眼病相似的效果。密蒙花总黄酮可能成为治疗干眼病的一个全新药物。
