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应用细胞应力加载系统建立HT-22细胞损伤模型的实验研究
目的 应用细胞应力加载系统建立HT-22细胞损伤模型.方法 采用Bioflex细胞培养板接种HT-22细胞,应用FX-5000TFL细胞应力加载系统进行牵张损伤(形变率为13.4％、频率为5.0 Hz).并按照时间的长短分为对照组和6、12、24h组.应用数字全息显微镜(DHM)动态检测细胞平均面积和平均厚度值,采用锥虫蓝染色法和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞存活率和LDH的释放情况,并通过流式细胞术检测细胞周期和Sub-G1期峰的变化.结果 (1)DHM检测结果显示:与对照组比较,损伤6h后HT-22细胞面积由(603.9±28.5) μm2降至(182.9 ±4.5)μm2(t=21.93,P＜0.01),细胞厚度由(4.0±0.2)μm升至(8.3 ±0.3) μm(t=16.65,P＜0.01).(2)细胞存活率结果显示:对照组细胞存活率为(95.0±1.6)％,而损伤后6 h[(59.7±4.5)％]较对照组显著下降(t=10.44,P＜0.01).损伤后12h和24 h的细胞存活率[分别为(77.0±2.9)％、(85.0±3.3)％]虽较6h组上升(分别为t=4.56,P＜0.05;t =6.45,P＜0.01),但仍低于对照组(分别为t=7.56,P＜0.01;t=3.873,P＜0.05).(3)LDH检测结果显示:细胞应力加载损伤后6h,LDH的释放水平[(273.9 ±4.6) ng/L]显著高于对照组[(51.7±5.8)ng/L,t=42.48,P＜0.01],而12 h组和24 h组LDH的释放水平[分别为(255.2±4.4)ng/L、(240.2 ±6.0) ng/L]均低于6h组(分别为t=4.14,P ＜0.05;t =6.28,P＜0.01).(4)流式细胞术检测结果显示:与对照组[(0.6±0.3)％]相比,损伤6 h组Sub-G1凋亡峰比例[(6.5±0.6)％]显著上升(t=14.90,P＜0.01),而细胞死亡比例随时间的延长而减少,尤以损伤24 h后[(2.1±0.5)％]的峰值较6h组降低为显著(t=9.61,P＜0.01).结论 应用细胞应力加载系统成功建立HT-22体外细胞损伤模型,该模型重复性好,操作简便,为进一步研究颅脑创伤的病理生理机制提供了一种精确、有效、可控的模型制作方法.
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皮质酮对海马HT-22细胞株锌含量的影响及机制研究
目的 通过观察皮质酮(corticosterone,CORT)对海马HT-22细胞总锌含量的影响,对其可能机制进行探讨,为研究应激相关疾病提供实验依据.方法 小鼠海马神经元HT-22细胞株,经10μmol/L CORT处理6h后,采用原子吸收分光光度计火焰法测定胞内总锌含量,并采用实时荧光定量PCR法检测MT1、MT3、ZnT1、ZnT3和ZIP1mRNA表达.结果 与对照组相比,10μmol/L CORT处理HT-22细胞6h后,HT-22细胞内总锌含量显著下降,而先于CORT处理前加入糖皮质激素受体阻断剂RU486组总锌含量与对照组无明显变化.与对照组相比,CORT组HT-22细胞MT1、MT3、ZnT1、ZnT3、ZIP1 mRNA表达水平上升,而先于CORT处理前加入糖皮质激素受体阻断剂RU486组上述基因mRNA表达均无明显变化.结论 CORT可影响海马HT-22细胞锌稳态调节分子的表达,进而影响细胞锌稳态失衡.
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RIP3介导的坏死性凋亡在HT-22细胞牵张损伤模型中的作用
目的 探讨受体相互作用蛋白3(RIP3)介导的坏死性凋亡在HT-22细胞牵张损伤模型中的作用及其机制.方法 将HT-22细胞接种在Bioflex培养板,采用细胞损伤控制仪(CIC),设定损伤参数(阀门压力30 PSI、气体脉冲压力3.5~4.5 PSI、气体脉冲时间50 ms),建立HT-22细胞牵张损伤模型.分别采用数字全息显微镜(DHM)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、流式细胞术、western blot法检测牵张损伤后6 h Ctrl组、CIC组、GSK'872组间细胞形态差异,LDH浓度变化,细胞周期分布,RIP3/受体相互作用蛋白1(RIP1)/混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)、Akt/p-Akt/mTOR/p-mTOR、Caspase-8/X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)蛋白表达变化.结果 与CIC组相比,应用GSK'872后细胞平均数量[(244.67±11.68)vs(190.67±15.28),t=4.865,P<0.01]、细胞平均面积[(260.14±16.81)μm2 vs(175.91±15.00)μm2,t=6.476,P<0.01]有所增加,细胞平均厚度有所减小[(6.12±0.47)μm vs(8.04±0.48)μm,t=4.942,P<0.01];LDH浓度有所下降[(222.74±11.06)ng/l vs(275.93±12.26)ng/l,t=5.581,P<0.01];细胞周期有所恢复[Sub-G1:(0.33±0.15)%vs(6.51±0.63)%,t=16.530,P<0.01;G0/G1:(46.67±2.96)%vs(33.04±7.07)%,t=3.085,P<0.05];能够降低RIP3[(0.73±0.04)vs(1.09±0.09),t=6.239,P<0.01]、RIP1[(0.75±0.05)vs(0.91±0.05),t=4.211,P<0.05]、MLKL[(0.56±0.03)vs(0.70±0.04),t=4.785,P<0.01]、Akt[(0.49±0.05)vs(0.77±0.05),t=6.763,P<0.01]、p-Akt[(0.88±0.05)vs(1.06±0.05),t=4.509,P<0.05]、mTOR[(0.81±0.02)vs(0.90±0.05),t=2.813,P<0.05]、p-mTOR[(0.65±0.05)vs(1.00±0.05),t=8.413,P<0.01]、XIAP[(0.50±0.05)vs(0.73±0.05),t=5.814,P<0.01]蛋白表达,并可促进Caspase-8蛋白表达持续升高[(0.96±0.05)vs(0.75±0.05),t=5.351,P<0.01],差异具有统计学意义.结论 RIP3介导的坏死性凋亡在HT-22细胞牵张损伤模型中起到重要作用,应用GSK'872可减轻HT-22细胞牵张损伤的程度,提示RIP3有可能成为将来临床上治疗颅脑创伤新的靶点.
