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miR-610通过调控缝隙连接α3蛋白的表达抑制人肺癌细胞的增殖和侵袭
目的 探讨miR-610对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制.方法 应用real-time PCR法检测miR-610在高低不同转移潜能肺癌细胞株95D和95C中的表达.分别将miR-610模拟物和抑制物转染入95D和95C细胞,应用细胞计数盒8(CCK-8)法和5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)掺入实验检测miR-610对肺癌细胞增殖的影响;应用划痕实验和Transwell侵袭实验检测miR-610对肺癌细胞侵袭的影响.以生物信息学软件预测miR-610的潜在靶基因,采用双荧光素酶报告基因系统和Western blot法验证miR-610对缝隙连接α3蛋白(GJA3)表达的调控作用.结果 miR-610在低转移肺癌细胞95C中的表达水平是其在高转移肺癌细胞95D中的表达水平的(8.75±0.21)倍(P＜0.01).空白对照组和转染miR-610抑制物组95C细胞的增殖细胞数分别为(37.41±2.39)％和(59.63±4.57)％,空白对照组和转染miR-610模拟物组95D细胞的增殖细胞数分别为(68.75±4.28)％和(46.13±3.27)％,差异均有统计学意义(均P＜0.01).划痕24h和48 h后,转染miR-610抑制物组95C细胞划痕的宽度分别为初始划痕宽度的(58.74±4.62)％和(34.63 ±2.73)％,均明显低于空白对照组和转染miR-610抑制物对照组(均P＜0.01);转染miR-610模拟物组95D细胞划痕的宽度分别为初始划痕宽度的(88.59±6.92)％和(72.24±5.46)％,均明显高于空白对照组和转染miR-610模拟物对照组(均P＜0.01).转染miR-610抑制物对照组、转染miR-610抑制物组95C细胞的侵袭细胞数分别为(112.4±10.6)个/空格和(161.8 ±12.5)个/空格,转染miR-610模拟物对照组、转染miR-610模拟物组95D细胞的侵袭细胞数分别为(178.4±12.3)个/空格和(76.7±5.8)个/空格,差异均有统计学意义(均P＜ 0.01).miRanda软件预测、双荧光素酶报告基因系统和Western blot法检测结果均表明,GJA3是miR-610调控的靶基因.结论 miR-610通过调控GJA3的表达抑制肺癌细胞的增殖和侵袭.
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微小RNA-125b对肺癌细胞95D生物学功能的影响
[目的]探讨微小RNA(miR)-125b对肺癌细胞95D生物学功能的影响. [方法]以95D细胞为实验对象,分别转染miR-125b模拟物和模拟物阴性对照,未经特殊处理为空白组.应用MTT法、流式细胞仪和Transwell小室法分别检测miR-125b表达改变对95D细胞增殖、凋亡、周期及侵袭的影响. [结果]95D细胞转染48h后,转染组miR-125b的水平提高,表达量为阴性对照组的22.32倍.与阴性对照组相比,miR-125b模拟物转染组细胞凋亡率明显降低[(13.77±0.52)％,(9.90±1.33)％,P＜0.05],细胞增殖、周期、侵袭无显著改变(P＞0.05). [结论]miR-125b基因过表达能够抑制肺癌95D细胞凋亡.
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miR-155对人肺癌95D细胞生物学行为的影响
目的:构建携microRNA-155(miR-155)的真核表达载体并观察其转染高转移性人巨细胞肺癌95D细胞后细胞的生物学行为变化.方法:以95D细胞基因组RNA为模板,经PCR法扩增miR-155的前体序列,由BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后将其亚克隆入真核表达载体pcDNA 3.1(-),并进行双酶切及测序鉴定;将构建成功的pcDNA3.1(-)-pri-miR-155载体(命名为p-miR-155)体外瞬时转染人肺癌95D细胞,利用Real-time PCR探针法检测miR-155成熟体的表达水平,并利用CCK-8法、克隆形成实验和划痕法检测95D细胞的增殖、克隆形成以及体外迁移能力.结果:成功构建携miR-155的真核表达载体;与空白(Mock)和对照组(p-Ctrl)相比,转染后的95D细胞过表达miR-155[(2.04±0.62)vs(0.76±0.62)、(1.00±0.45),均P＜0.01]、p-miR-155载体转染组95D细胞的增殖抑制明显增加[(46.70±6.89)％vs(3.70±1.40)％、(1.11±0.75)％,P＜0.01]、克隆形成能力(在100和1 000个细胞/孔接种条件下)明显下降[(12±3) vs (34±3)、(35±3)个,P＜0.01;(78 ±4)vs(159±4)、(165 ±4)个,P＜0.01)],此外,细胞的迁移细胞数也明显减少[(110±5) vs (295 ±5)、(325±5)个,P＜0.0l].结论:通过miR-155真核表达载体转染产生的过表达miR-155可显著抑制人肺癌95D细胞的增殖和迁移能力.
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miR-29c过表达载体的构建及其对95D肺癌细胞增殖的影响
目的 构建miR-29c真核表达载体并转染95D肺癌细胞,观察miR-29c过表达对95D细胞增殖能力的影响.方法 克隆miR-29c片段插入质粒pcDNA3.1,构建miR-29c表达质粒pcDNA3.1-miR-29c;通过脂质体瞬时转染人肺癌细胞株95D,荧光PCR检测细胞miR-29c表达水平,MTT法检测过表达miR-29c对细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒pcDNA3.1-miR-29c经酶切及测序证明构建成功,荧光PCR证实转染后95D细胞miR-29c表达水平显著升高,是对照组的36倍.MTT检测结果表明,过表达miR-29c的95D细胞增殖受到显著抑制,至72 h抑制率高,达38.63％.结论 成功构建miR-29c真核表达质粒pcDNA3.1-miR-29c,初步观察显示过表达miR-29c显著抑制95D肺癌细胞增殖效应.为进一步深入研究miR-29c对肺癌的作用打下良好基础.
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过表达microRNA-7对人肺癌95D细胞凋亡的影响
目的 探讨过表达microRNA-7对人肺癌95D细胞体内外凋亡的作用.方法 将miR-7真核表达载体(命名为p-miR-7)体外瞬时转染人肺癌95D细胞,利用TUNEL法观察95D细胞凋亡的变化;免疫荧光技术检测各组细胞磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白的表达;建立人肺癌裸鼠模型,肿瘤局部注射p-miR-7后利用TUNEL法检测肿瘤局部细胞凋亡变化,同时,免疫组织化学法检测凋亡相关的磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白的表达变化.结果 体外转染p-miR-7后可导致人肺癌细胞的凋亡(P＜0.05).同时,细胞中磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白水平显著增加(P＜0.05);肿瘤局部注射p-rniR-7后,肿瘤局部miR-7表达水平及细胞凋亡也明显增强(P＜0.05),磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白水平也显著增加.结论 过表达miR-7可以导致肿瘤细胞凋亡,这与凋亡相关蛋白Caspase3和Caspase9磷酸化水平增加有关.
关键词： microRNA-7 肺癌 细胞凋亡 95D细胞 -
自身启动子调控miR-7真核表达载体的构建及其意义
目的 构建带有miR-7自身启动子的miR-7重组真核表达载体,研究其对人肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响.方法 预测miR-7启动子序列,设计含有该序列和miR-7前体序列目的片段的引物,PCR扩增后亚克隆入pGL3.0-Basic载体以构建miR-7自身启动子调控的真核表达载体pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(命名为p-miR-7-pro);将所构建载体转染人肺癌95D细胞,Real-time PCR探针法检测95D细胞中miR-7的表达水平;MTT和克隆形成实验分别检测95D细胞的增殖和克隆形成能力;划痕法观察95D细胞体外迁移能力的变化;FACS检测95D细胞的凋亡情况.结果 酶切和测序结果证明成功构建p-miR-7-pro真核表达载体,转染95D细胞后可有效表达miR-7;与对照组相比,p-miR-7-pro转染组95D细胞的体外增殖能力受到明显的抑制(0.60 ±0.03 vs 0.19 ±0.05,P＜0.05);同时其迁移能力也显著降低(473 ±7 vs 99 ±2,P＜0.05);而细胞凋亡则显著增加(9.233 ±0.586％vs 12.967 ±0.643％,P＜0.05).结论 成功构建由自身启动子调控的miR-7真核表达载体,为后续研究miR-7在肺癌基因治疗中的作用提供重要实验基础.
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pG-miR-7-Sponge转基因小鼠载体的构建及鉴定
目的 构建pG-miR-7-Sponge转基因小鼠的真核载体并检测其表达活性,为转基因小鼠的建立提供前期实验基础.方法 利用miRNA sponge(海绵体)技术原理,合成miR-7-Sponge序列,酶切连接入真核表达载体eGFP-C2并转化Stbl3感受态细胞,克隆PCR、酶切和测序鉴定重组载体eGFP-C2-miR-7-Sponge(简称pG-miR-7-Sp);将重组载体pG-miR-7-Sp体外瞬时转染人肺癌95D细胞,荧光显微镜下观察细胞的GFP表达情况;Real-Time PCR检测细胞中miRNA-7的表达;MTT法检测细胞的增殖变化.结果 经克隆PCR、酶切鉴定及测序分析,成功构建了真核表达载体pG-miR-7-Sp;pG-miR-7-Sp瞬时转染95D细胞48 h后,与对照组细胞相比,miR-7表达水平明显降低(P＜0.05);同时细胞的生长明显加快(P＜0.05).结论 成功构建pG-miR-7-Sp真核表达载体.
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过表达miR-126对人肺癌细胞体外生长的抑制作用和初步机制研究
目的:探讨过表达miR-126对人肺癌95D细胞体外生长的影响.方法:利用PCR技术成功构建pcDNA3.1(-)-pri-miR-126载体(命名为p-miR-126),将p-miR-126重组质粒体外瞬时转染人肺癌95D细胞,TaqMan探针法检测miR-126的相对表达水平,CCK-8(cell counting kit-8)法和划痕法分别检测95D细胞的增殖、迁移能力.Western Blot检测95D细胞中蛋白AKT和磷酸化AKT(phosphorylation AKT,p-AKT)的表达情况.结果:成功构建miR-126真核表达载体,且该载体可上调miR-126表达(P＜0.05),抑制95D细胞的生长和迁移能力(P＜0.05).Western Blot结果表明细胞中磷酸化AKT水平显著降低(P＜0.05).结论:通过上调miR-126的表达水平可有效抑制95D细胞的体外生长,其作用机制有可能与AKT信号通路的变化有关,但其具体机制仍需后续深入研究.
