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SASH1基因通过p53信号通路调节乳腺癌细胞增殖
目的 探讨SASH1基因对乳腺癌细胞增殖的作用及其与P53基因的关系.方法 购买134例乳腺癌组织芯片(上海芯超科技有限公司,芯片型号:HBre-Duc150Sur-01),用SASH1和p53抗体进行组织芯片免疫组织化学染色分析.构建重组质粒SASH1-PEGFP-C3(GFP-SASH1)、HA-p53-pcDNA3.0(HA-Tp53),定点突变SASH1基因上581、594、605、610位点(D581 V-SASH1、W594L-SASH1、F605S-SASH1、V610E-SASH1)和p53基因上175、248、273位点(R175H-p53、R248W-p53、R273H-p53).实验分组如下:(1)将0、0.5、1.0、2.0、4.0 μg的HA-Tp53单独转染或分别与2.0 μg的GFP-SASH1共同转染至HEK-293T细胞,用Western blot检测p53对GFP-SASH1和endo-SASH1表达的影响.(2)将0、0.5、1.0、2.0、4.0 μμg的GFP-SASH1单独转染或分别与2.0 μg的HA-Tp53共同转染至HEK-293T细胞,用定量RT-PCR检测p53 mRNA及蛋白表达.(3)2.0μg的HA-pcDNA3.0(空载体),野生型p53(wt-p53),突变型R175H-p53、R248W-p53、R273H-p53单独转染或分别与2.0μg的GFP-SASH1共同转染至HEK-293T细胞,用Western blot检测GFP-SASH1和endo-SASH1表达.(4)将2.0 μg的空载体,野生型-SASH1,突变型D581V-SASH1、W594L-SASH1、F605 S-SASH1、V610E-SASH1单独转染或与2.0 μg的HA-Tp53共同转染HEK-293T细胞,另设未经处理细胞为空白对照,Western blot检测HA-Tp53和endo-Tp53表达.用Spearman相关系数法对SASH1与p53免疫组织化学结果进行分析,用单因素方差分析方法比较SASH1与p53的表达量,两两比较采用LSD-t法.结果 在134例人乳腺癌组织芯片中,SASH1和p53的表达呈正相关(r=0.319,P＜0.001).其中,SASH1(-)4例、(+)42例、(++)67例、(+++)20例、(++++)1例,p53(-)82例、(+)36例、(++)10例、(+++)6例.随着HA-rp53转染剂量的增大,外源性SASH1(GFP-SASH1)和内源性SASH1(endo-SASH1)的表达水平都增高(F=205.369、178.238,P均＜0.001).随着GFP-SASH1转染剂量的逐渐增大,HA-Tp53 mRNA及蛋白表达量逐渐增加(F=67.481、506.538,P均＜0.001).突变型SASH1使内源性和外源性p53表达上调(F=165.767、1136.930,P均＜0.001);突变型p53抑制内源性和外源性SASH1表达(F=57.142、354.517,P均＜0.001).结论 SASH1与p53正相关,对乳腺癌细胞增殖起调节作用.
