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人源性食管鳞癌cDNA文库的构建及鉴定
目的:构建人源性食管鳞癌cDNA噬菌体表达文库.方法:从人食管鳞癌组织中提取总RNA并分离纯化mRNA,用RT-PCR合成cDNA单链,LD-PCR扩增双链cDNA,除去＜500 bp的小片段,与载体λTriplEx2噬菌体左右臂连接,经体外包装即构成全长cDNA 噬菌体表达文库.转化E.coli XL1-Blue感受态细胞,测定文库的滴度,确定文库的容量大小,用蓝白筛选测定文库的重组率,PCR鉴定cDNA插入片段的大小.结果:构建的人源性食管鳞癌cDNA噬菌体表达文库滴度为1.64×106 pfu/mL,重组率为98.6%,cDNA插入片段的大小为0.7～2.5 kb,平均长约1.5 kb.结论:成功构建1个人源性食管鳞癌cDNA噬菌体表达文库,适合于大批量筛选cDNA克隆的食管鳞癌肿瘤抗原基因.
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酵母双杂交筛选NGAL相互作用蛋白
目的:中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白(neutrophil gelatinase-assiociated lipocalin,NGAL)功能不明,籍筛选与之相互作用蛋白,构筑相互作用图谱,为揭示其功能提供新途径.方法:利用蛋白质相互作用原理,应用酵母双杂交技术,构建Pgbkt7-NGAL载体,以NGAL为诱饵,在人类骨髓Cdna文库中筛选与之相互作用蛋白的基因.结果:通过酵母交配筛库、一对一验证和β-gal分析筛选出40个阳性克隆;测序,利用网上数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对序列进行比对,初步确定了31种基因,其中11种为未知基因,20种为已知基因.已知基因中含有编码区的有LGAIS1、MT2A、COX1、RNP24、ATP1B3、IGL、IGHVDJ、RARRES2、GYPA、NEB和NPC2.结论:筛选得到31种可能与NGAL相互作用蛋白的基因,这为研究NGAL功能及作用机制提供了新途径.
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内皮差异表达基因消减文库的构建及在创伤修复中的应用
目的:建立人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因的消减cDNA文库.方法:提取培养人脐静脉内皮细胞内毒素刺激6 h后mRNAs,反转录合成cDNA,与对照组间进行抑制消减杂交富集差异表达基因,亚克隆入T/A质粒并转化感受态大肠杆菌.结果:成功构建了人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后上调和下调差异表达基因两个消减cDNA文库,为进一步筛选新的内皮细胞活化相关基因打下基础.结论:经抑制消减杂交建立的消减cDNA文库富集并均一化了内毒素刺激后不同丰度的差异表达基因,对深入理解内皮细胞活化机制及参与组织修复的过程具有重要意义.
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应用抑制性消减杂交技术筛选脂肪细胞分化相关基因
目的:利用脂肪分化细胞模型筛选与脂肪细胞分化相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以诱导分化后的人前体脂肪细胞系SW872总RNA为Tester,诱导分化前的人前体脂肪细胞系SW872为Driver,将消减杂交获得的DNA片段与pGM-T载体连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,并与GenBank数据库进行同源性分析,获得差异性表达基因.结果:扩增消减cDNA文库获得135个白色克隆,随机挑选64个进行测序,共获得34个阳性克隆基因.结论:本研究成功构建了脂肪细胞分化差异性表达基因的消减cDNA文库,筛选出了与脂肪细胞分化相关的差异表达基因.
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人源性抗乳腺癌HER2噬菌体单链抗体库的构建与筛选
目的:构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体(scFv)库,筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体2(HER2)特异性scFv,为HER2和CXC趋化因子受体4 (CXCR4)双靶向融合蛋白的研制提供靶向HER2的高亲和力序列.方法:取已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织,提取总RNA;构建可变区基因的T载体库,将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因与pCANTAB连接肽连接,获得pCANTAB-scFv,电转化感受态大肠杆菌TG1;以M13K07辅助噬菌体进行感染,获噬菌体抗体库;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测筛选后获得的噬菌体抗体活性,以免疫组织化学法检测抗体亲和力,并通过测序进一步鉴定.结果:成功构建大容量pCANTAB-scFv抗体库,获得的scFv长度为750 bp,VH和VL长度分别为375和330 kb;电转化大肠杆菌TG1后酶切验证插入片段大小正确,得到库容为2.48×108的大容量抗体库;通过噬菌体展示和淘洗筛选,富集针对乳腺癌细胞株SKBR-3表面抗原的抗体库;所得抗体对HER2有高度的亲和力和特异性,对乳腺癌组织HER2抗原也具有较高的亲和力;测序结果与人IgG抗体进行对比,所获得的scFv具有高度的人源性.结论:主要构建了大容量人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体scFv库,并筛选获得可特异性识别人乳腺癌HER2的高亲和力scFv,为制备以HER2为靶点的抗肿瘤HER2和CXCR4双靶向融合蛋白提供了载体.
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联合应用噬菌体展示技术与重组cDNA表达文库血清学分析技术筛选肺癌早期诊断相关抗原
目的:筛选有效的人肺癌早期诊断相关抗原,以提高肺癌的早期诊断水平.方法:构建人早期肺癌cDNA T7噬菌体展示文库;筛选出差异性噬菌体克隆,测序后进行生物信息学分析;后利用重组cDNA表达文库血清学分析(SEREX)技术对8个差异性噬菌体克隆构建肺癌相关抗原微阵列,分别与肺癌患者和正常人的血清反应,评价各个抗原单独应用与联合应用诊断肺癌的价值.结果:构建的肺癌T7噬菌体展示文库的滴度为3.71×106 pfu/ml,噬菌体数为1.11×106 pfu.cDNA文库的重组率超过90％.筛选出9个差异性噬菌体克隆,测序后发现A42与A83抗原的基因序列相同.生物信息学分析发现8个抗原的基因均为已知基因,除了A64以外,其余与肿瘤均有明确的关系.8个抗原与肺癌患者血清的阳性反应率均高于与正常人血清的阳性反应率,差异均具有统计学意义(均P ＜0.05).在特异性不低于60％的情况下,各个抗原单独用于肺癌诊断时的灵敏性均低于70％.各个抗原的曲线下面积均低于0.8.而复合抗原诊断肺癌的灵敏性为90.8％,特异性为94.1％,曲线下面积高达0.969.结论:本研究成功构建了库容量大、重组率高、代表性好的人肺癌T7噬菌体展示文库,并筛选到8个肺癌相关抗原.由这8个抗原组成的复合抗原诊断肺癌的灵敏性与特异性均在90％以上,诊断价值较高.
