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克隆与表达产甲酸草酸杆菌代谢基因Frc及临床意义
目的 研究产甲酸草酸杆菌草酸代谢基因Frc转化大肠杆菌BL21后稳定表达代谢草酸相关性酶--甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)对草酸的降解效能.方法 成功培养产甲酸草酸杆菌后,采用PCR方法从产甲酸草酸基因组中获得Frc基因,克隆到pMDTM19-T载体上进行测序,得到正确的基因片段.经双酶切将目的 基因片段插入到原核表达载体PGEX-4T-2上,测序正确后,转化大肠杆菌BL-21,IPTG诱导表达GST-FCoAT融合蛋白,表达产物行western-blot鉴定分析.结果 重组克隆载体pMDTM19-Frc经测序鉴定序列正确.成功构建融合原核表达质粒PGEX-4T-2-Frc,大肠杆菌BL21成为载体,并稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT的同时获得代谢草酸潜能.结论 克隆产甲酸草酸杆菌Frc基因,成功构建PGEX-4T-2-Frc载体,并转化大肠杆菌BL21,能稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT,具有代谢草酸潜能,为肠道细菌获得代谢草酸潜能,减少胃肠道内草酸的吸收,降低尿液中草酸含量和临床防治草酸结石的研究奠定理论基础.
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表达产甲酸草酸杆菌草酸分解基因的人肝细胞系的构建
目的:构建表达产甲酸草酸杆菌(Ox.F)草酸分解基因的人肝细胞系,探索高草酸尿的治疗方法.方法:分离培养人肠道Ox.F并克隆其功能基因oxc和frc,构建同时表达oxc和frc的真核双表达载体质粒pIRES-oxc-frc,将pIRES-oxc-frc转染人正常肝细胞系L-02.用RT-PCR和Western blot技术了解转基因细胞的目的基因表达状况;用离子色谱法测定转基因后细胞培养液中草酸浓度,了解其草酸分解功能.结果:转基因后人肝细胞系L-02在mRNA和蛋白质水平均成功表达oxc和frc基因,其草酸分解功能较转染前明显增强(P＜0.01).结论:Ox.F分解草酸的两个重要功能基因oxc和frc能在体外转入人正常肝细胞(L-02)中,并使后者草酸分解能力明显增强.转草酸分解基因的人肝细胞系的构建,有望用于高草酸尿,尤其是PH的病因治疗,值得进一步研究.
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人肠道产甲酸草酸杆菌的分离培养
目的探讨产甲酸草酸杆菌分离培养及鉴定方法.方法应用选择性培养基,在37 ℃厌氧环境下分离培养人肠道产甲酸草酸杆菌.通过观察菌落形态、细菌涂片染色镜检、离子色谱仪及核酸序列分析,对细菌进行鉴定.结果产甲酸草酸杆菌菌落形态为白色点状或梭状,大小约(0.1～0.5) mm×(1.0～3.0) mm;菌落周边出现直径约3.5～4.5 mm的清晰透明圈.该细菌为革兰氏阴性杆菌,大小约(1.0～1.6) μm×(3.0～6.5) μm.液体培养基中草酸浓度随细菌浓度增加而逐渐下降.与文献报道核酸序列比较,该细菌分解草酸的功能基因frc、oxc的核酸同源性分别为95.8%及93.6%.结论产甲酸草酸杆菌可通过选择性培养基、在厌氧环境下从人粪便中分离出来.
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草酸钙结石患儿的肠道产甲酸草酸杆菌与尿草酸的关系
目的 探讨特发性草酸钙结石患儿的肠内产甲酸草酸杆菌的定殖以及与24h尿草酸的关系.方法 应用聚合酶链反应(PCR)检测20例特发性草酸钙结石患儿(2～18岁)的大便样本中的产甲酸草酸杆菌的存在.根据年龄、性别匹配20名健康儿童作为对照组.同时,留取这些儿童的24h尿并使用离子色谱法测定尿草酸含量.结果 在结石组中,6例检出产甲酸草酸杆菌(30％).与正常对照组比较,其定殖率差异无统计学意义(40％,P＞0.05).在结石组中,检测到肠道定殖产甲酸草酸杆菌的患儿的24 h尿草酸排泄要明显低于未检测到定殖的患儿[(0.79±0.29) mmol/(kg·24 h)比(1.16 ±0.32) mmol/(kg·24 h),P＜0.05].结论 特发性草酸钙结石患儿的高草酸尿排泄可能是因为肠道内产甲酸草酸杆菌缺乏导致.
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产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因和草酰辅酶A脱羧酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定
目的 构建国人肠道来源产甲酸草酸杆菌(OxCF)甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)基因(FRC)和草酰辅酶A脱羧酶(OCoAD)基因(OXC)的重组慢病毒pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED,为高草酸尿症的基因治疗奠定基础.方法 采用Taq高保真DNA聚合酶从OxCF基因组中扩增FRC基因和OXC基因片段,用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收,用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-T Simple载体连接获得FRC和OXC的克隆载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆并测序,筛选携带完整目的基因质粒pMD18T simple-FRC和pMD18T simple-OXC,用BamH Ⅰ酶切获得目的基因,连接FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6.3/v5DEST-IRES-EGFP,连接OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-DsRED,转化DH5α后挑取阳性克隆并测序.构建的慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染HEK293T细胞,包装并测滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)从OxCF基因组中扩增分获得1.3kb和1.7kb的DNA片段,与Genbank中FRC( U82167)间碱基序列匹配率为95.88％,存在53个碱基的变异；与Genbank中OXC( M77128)间碱基序列匹配率为93.61％,存在109个碱基的变异；测序证实pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED分别含有大小正确的正向FRC cDNA和OXC cDNA,转染HEK293T细胞实验24h后,在荧光显微镜下相应可见大量绿色荧光和红色荧光,两种慢病毒滴度分别为1.15×108 TU/ml和9.75×107 TU/ml.结论 成功构建表达OxCF中草酸分解关键基因FRC和OXC的重组慢病毒载体,并通过转染293细胞制备了高滴度慢病毒.
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中国人肠道产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因的分离、克隆和鉴定
目的 克隆产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因(frc),检测其在真核细胞中的表达.方法 用聚合酶链式反应技术从产甲酸草酸杆菌基因组DNA中扩增frc基因片段并插入真核表达载体获取重组质粒pEGFP-frc,通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定重组质粒.重组质粒转染人胚肾293细胞,检测frc基因在mRNA和蛋白水平上的表达.被转染细胞在含草酸培养液中培养,检测0～72 h培养液中草酸浓度的变化.结果 frc基因的真核表达载体构建成功.转染293细胞后24～72 h,可观察到明亮的绿色荧光,在mRNA和蛋白水平上可检测到frc基因在真核细胞中的表达.转染pEGFP-frc细胞12～72 h培养液中草酸浓度明显低于转染空载体的细胞(P＜0.05).结论 中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可分离出frc基因;frc基因可在真核细胞293细胞中表达并使293细胞获得代谢草酸的能力.
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产甲酸草酸杆菌基因frc和oxc在人骨髓间充质干细胞中的表达
目的:将产甲酸草酸杆菌(OXF)草酸分解基因frc和oxc分别克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-N1和pBaBE-puro,共转染正常成人骨髓间充质干细胞(hMSCs),使frc和oxc基因在hMSCs中稳定表.方法:以本实验室保存的OXF基因组为模板,PCR法扩增出frc和oxc基因的编码序列,采用逆转录病毒载体将frc和oxc导入hMSCs中,Q-PCR和Western blot检测其表达.结果:重组载体pLEGFP-N1-myc-frc、pBaBE-puro-flag-oxc构建成功;并检测出frc和oxc基因在hMSCs中的稳定表达.结论:逆转录病毒载体介导的frc和oxc能成功转染hMSCs,能为以后体外诱导分化为肝细胞,治疗内源性高草酸尿奠定基础,为下一步的实验提供原材料.
