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简易快速获得大量高纯度大鼠Leydig细胞
目的 建立一种简易快速获得高纯度睾丸间质内莱迪希(Leydig)细胞的分离方法.方法 联合应用复合胶原酶消化、400目(30 μm)不锈钢滤网过滤和差速贴壁法获得雄性Wister大鼠睾丸间质内的Leydig细胞.分离细胞经3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)特异性酶学染色、免疫细胞化学检测和流式细胞学进行细胞表型鉴定和纯度分析.将分离细胞进行原代及传代培养,部分细胞同时给予人绒毛膜促性腺激素(HCG)刺激,观察传代后细胞生长情况,并测定HCG刺激组和非刺激组各代细胞培养上清睾酮水平,评价分离细胞的增殖能力、睾酮分泌功能及对HCG的反应.有血清和无血清2种条件培养液培养原代分离细胞,倒置相差显微镜及电镜观察细胞老化和凋亡状况,优化Leydig细胞的培养条件.结果 应用差速贴壁方法每克睾丸组织(湿重)可获得Leydig细胞(1.5±0.8)×106个,3β-HSD特异性酶学染色、免疫细胞化学检测均呈阳性反应.流式细胞学检测证实3β-HSD阳性细胞率为(95.2±3.7)%.传代后未见明显的细胞增殖,但仍可检测到3β-HSD表达.原代及传代细胞均具有睾酮生成功能,HCG刺激后睾酮分泌水平均明显上升,但原代细胞一定水平的睾酮分泌可持续6 d以上,传代后细胞仅持续48 h.结论 应用差速贴壁法可以获得大量高纯度有活性的Leydig细胞,并可以进行传代培养,且传代前后短期内均可分泌睾酮.该方法简单易行,细胞得率高.
关键词： Leydig细胞 3β-羟类固醇脱氢酶 睾酮 组织工程 -
3β-HSD基因沉默或高表达对DEHP致细胞氧化损伤的影响
目的 研究邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(DEHP)对MCF-7细胞的氧化损伤作用,探讨3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)基因沉默或高表达对DEHP致氧化损伤作用的影响.方法 体外培养MCF-7细胞、3β-HSD基因沉默细胞、3β-HSD基因高表达细胞,DEHP对细胞染毒,以MCF-7细胞为对照,不同浓度DEHP(0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mmol/L)分别染毒24 h,测定3种细胞内氧化损伤指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的变化,荧光定量PCR检测DNA损伤修复基因hOGG1、hMTH1 mRNA表达变化, Western blot法检测hOGG1、hMTH1蛋白表达变化.结果 DEHP染毒MCF-7细胞后,与对照组(DEH P 0 mmol/L)比较,MDA含量升高,SOD活力、GSH含量、GSH-PX活力降低,hOGG1、hMTH1 mRNA表达水平升高,hOGG1、hMTH1蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).DEHP染毒3β-HSD沉默细胞后,与同染毒剂量组的MCF-7细胞比较,3β-HSD沉默细胞中MDA含量升高,SOD活力、GSH含量、GSH-PX活力降低,hOGG1、hMTH1 mRNA表达水平降低,hOGG1、hMTH1蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).DEHP染毒3β-HSD高表达细胞后,与同染毒剂量组的MCF-7细胞比较,3β-HSD高表达细胞中MDA含量降低,SOD活力、GSH含量、GSH-PX活力升高,hOGG1、hMTH1 mRNA表达水平升高,hOGG1、hMTH1蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论 DEHP可引起MCF-7细胞发生氧化损伤,诱导相关基因及蛋白发生改变;3β-HSD基因沉默使DEHP致氧化损伤加重,3β-HSD基因高表达使DEHP致氧化损伤减轻, 3β-HSD基因在DEHP致氧化损伤中具有重要作用.
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恐惧应激对雄性大鼠生殖相关参数的影响
目的 观察比较恐惧应激状态下不同应激时间段大鼠体重、睾丸和附睾重量、精子数目、3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)蛋白表达的变化.方法 建立SD大鼠的恐惧应激模型,分别取急性应激和慢性应激状态下SD大鼠睾丸、附睾称重,并对附睾尾精子计数,HE染色观察睾丸结构,免疫组织化学和western blotting分析3β-HSD表达,比较各实验组和对照组间上述指标的变化.结果 急性应激组与对照组相比,大鼠体重、睾丸重量、附睾重量、精子数量没有明显变化(P＞0.05),HE染色显示睾丸结构无明显变化,免疫组化显示3β-HSD表达降低,western blotting分析3β-HSD降低了7%;慢性应激组与对照组相比,大鼠体重、睾丸重量、附睾重量、精子数量都有显著差异,P＜0.05.HE染色显示睾丸内生精小管细小,管腔内生精细胞稀少,免疫组化显示3β-HSD表达降低,western blotting分析3β-HSD降低了19.8%.结论 急性应激没有破坏雄性大鼠机体内稳态的调节能力,对生殖的影响仅见于睾丸功能的改变,睾丸组织结构未发生变化;而长期处于应激状态下的雄性大鼠,超出机体内稳态的调节能力,对生殖的影响不仅表现在3β-HSD的表达下降,而且睾丸组织结构发生变化.提示应激是影响大鼠生殖功能的一个因素.
关键词： 恐惧 应激 3β-羟类固醇脱氢酶 大鼠 -
膜联蛋白5对雄性SD大鼠睾酮合成相关蛋白和酶表达的影响
目的 研究注射膜联蛋白5后雄性SD大鼠睾丸类固醇急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme,P450scc)和3β-羟类固醇脱氢酶(3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)表达的改变,初步探讨膜联蛋白5影响睾酮分泌的机制.方法 将20只SD大鼠随机分为对照组和实验组,实验组又分为7.5μg/kg组、15μg/kg组和30μg/kg组,每组5只.对照组大鼠腹腔注射等量的pH 8.0Tris-HCl,实验组腹腔注射不同剂量的膜联蛋白5,1次/d,连续20d.用RT-PCR方法分别检测对照组和各实验组SD大鼠睾丸组织中睾酮合成相关的StAR、P450scc和3β-HSD mRNA的表达变化,并用Western blot方法检测以上3种物质蛋白质水平的变化.结果 与对照组相比,在mRNA水平上,7.5μg/kg组和15μg/kg组大鼠睾丸组织P450scc mRNA表达分别增加了25.9%[(0.68±0.04) vs (0.54±0.03),P<0.01]和27.8%[(0.69±0.04) vs (0.54±0.03),P<0.01];3β-HSD mRNA表达分别升高了32.9%[(1.05±0.07) vs (0.79±0.10),P<0.01]和53.2%[(1.21±0.07) vs (0.79±0.10),P<0.01];而30μg/kg组表达差异无统计学意义;在蛋白水平上,15μg/kg组大鼠睾丸组织P450scc蛋白表达提高了34.2%[(0.37±0.04) vs (0.28±0.02),P<0.01],7.5μg/kg组和15μg/kg组的3β-HSD表达也分别增加了14.7%[(1.53±0.10) vs (1.34±0.05),P<0.01]和24.4%[(1.67±0.14) vs (1.34±0.05),P<0.01];而StAR的表达无论在转录水平还是在蛋白水平上,较对照组差异均无统计学意义.结论 膜联蛋白5可通过调节P450scc与3β-HSD的表达来调节睾酮合成.
关键词： 膜联蛋白5 类固醇急性调节蛋白 胆固醇侧链裂解酶 3β-羟类固醇脱氢酶 -
急性疼痛应激对雄性SD大鼠生殖相关指标的影响
目的:多种应激方式均能抑制生殖功能,建立甲醛诱导的急性疼痛模型,观察急性疼痛应激对雄性SD大鼠精子计数、生殖器官重量及睾丸内3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)表达的影响,并对急性疼痛应激状态下雄性大鼠生殖系统伤害程度进行评价,为寻找应激状态下保护生殖系统的方法提供依据. 方法:单侧后足底皮下注射5%甲醛0.2ml,建立SD大鼠急性疼痛应激模型,分别取对照组和急性疼痛应激组SD大鼠睾丸、附睾进行称重,并对附睾尾精子计数.苏木精-伊红染色观察睾丸结构.免疫组化染色后经Imageproplus 6.0软件分析平均光密度,比较不同组大鼠睾丸内3β-HSD的表达. 结果:与对照组相比,应激组大鼠体质量、睾丸质量、睾丸指数、附睾尾重和精子计数无统计学意义(P>0.05).附睾指数在甲醛注射后1、6、24h显著高于对照组(P<0.05).苏木精-伊红染色显示睾丸形态结构没有明显差异.免疫组化平均光密度分析显示,与对照组相比,在甲醛注射后1h,3β-HSD平均光密度显著低于对照组(P<0.05),其余各时间段均无明显差异(P>0.05).比较甲醛注射后不同时间段3β-HSD表达情况,发现注射后1、6、24、72h,随时间变化3β-HSD表达先降低再逐渐升高,且注射后1h较72h差异显著(P<0.05). 结论:甲醛诱导的急性疼痛应激对睾丸、附睾体质量及生精功能无明显影响,而对睾丸分泌睾酮功能主要表现为影响睾丸内3β-HSD的表达.急性疼痛应激对睾丸分泌功能的影响能在机体内稳态机制调节下恢复.
关键词： 疼痛 应激 3β-羟类固醇脱氢酶 -
促性腺激素释放激素类似物对大鼠睾丸间质细胞膜联蛋白5和3β-羟类固醇脱氢酶mRNA表达的影响
目的:观察促性腺激素释放激素(GnRH)类似物对大鼠睾丸间质细胞annexin 5和3β-HSD mRNA表达的影响. 方法:原代培养大鼠睾丸间质细胞48h后,分别用不同终浓度的GnRH激动剂(GnRH-agonist, GnRHa)(10-5mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L)和GnRH 拮抗剂(GnRH-antagonists, GnRHant)(10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L)处理细胞,提取细胞总RNA,反转录,设计特异性引物和Tagman探针,荧光定量PCR检测膜联蛋白5(annexin 5)和3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD) mRNA表达的改变. 结果:荧光定量PCR结果显示,与未加GnRH类似物的对照组相比,当GnRHa的终浓度为10-5mol/L、10-6mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞annexin 5 mRNA 分别升高了38.89%和35.29%,均具有统计学意义(P<0.05);当GnRHa的浓度为10-5mol/L时,3β-HSD mRNA也显著升高了46.43%(P<0.01).同样,与对照组相比,当GnRHant的浓度为10-6mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞annexin 5 mRNA下降了45.45% (p<0.05),当GnRHant的浓度为10-6mol/L,10-7mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞3β-HSD mRNA也分别显著地降低了63.64%(P<0.01)和50%(P<0.05),其余各组与对照组相比,差异无统计学意义. 结论:GnRH类似物能够调控大鼠睾丸间质细胞annexin5和3β-HSD mRNA表达,GnRH类似物可能与睾丸间质细胞上GnRH受体结合后,通过特定的生理机制,进而影响annexin5和3β-HSD mRNA表达,为揭示GnRH类似物调控间质细胞分泌睾酮的作用机制提供了一定的依据,其内在的机制还有待进一步研究.
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小鼠睾丸组织中核受体4A1的表达变化及体外对睾丸间质细胞睾酮合成的影响
目的：观察核受体（ NR）4A1在不同鼠龄小鼠睾丸组织中的表达变化及NR4A1对体外小鼠睾丸间质细胞睾酮合成的影响，并探讨其机制。方法1周龄、4周龄、12周龄、12月龄雄性小鼠各6只，分别为幼年组、性发育前组、性成熟组及老年组。饲养3 d，适应环境后，各组小鼠全部脱颈处死，取双侧新鲜睾丸组织，采用real-time PCR法检测NR4A1 mRNA，Western blotting法检测NR4A1蛋白。体外培养小鼠睾丸间质细胞系MLTC-1，分别将NR4A1干涉腺病毒（ Ad-siNR4A1）及空载腺病毒（ Ad-CMV）转染MLTC-1。采用放射免疫法检测MLTC-1细胞培养液上清中的睾酮，real-time PCR法检测MLTC-1中的类固醇快速转运蛋白（ StAR）、3β-羟类固醇脱氢酶（ HSD3B） mRNA，Western blotting法检测StAR、HSD3B蛋白。结果幼年组、性发育前组、性成熟组、老年组小鼠睾丸组织中NR4A1 mRNA相对表达量以性发育前组高，与余3组相比，P均＜0．05；NR4A1蛋白相对表达量以性成熟期组高，与余3组相比，P均＜0．05。转染Ad-siNR4A1、Ad-CMV的MLTC-1中睾酮水平分别为（2．55±0．23）、（4．50±0．23）nmol／L，两者相比，P＜0．05。转染Ad-siNR4A1的MLTC-1中StAR、HSD3B mRNA及其蛋白相对表达量与转染Ad-CMV的细胞相比，P均＜0．05。结论不同鼠龄小鼠睾丸组织中NR4A1的表达有所差别；NR4A1可能通过调控StAR、HSD3B表达从而参与睾酮的合成。
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3β-HSD基因高表达细胞株建立及其对DEHP致凋亡影响研究
目的 构建3β-HSD高表达细胞株,研究3β-HSD高表达对塑化剂DEHP致凋亡的影响.方法 根据GenBank上3β-HSD基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒载体pLVX-CMV-ZSgreen-PGK-Puro,然后转染至MCF-7细胞中,对细胞株进行鉴定.用不同剂量DEHP对3β-HSD高表达细胞和MCF-7细胞染毒24h,在基因和蛋白表达水平上检测Bax、Caspase-3、Caspase-8的变化.结果 基因测序验证本文构建的3β-HSD基因高表达载体基因序列与GenBank中的序列一致,荧光定量PCR结果显示3β-HSD基因表达水平升高105倍,western blot结果显示3β-HSD蛋白表达水平升高80％.DEHP染毒MCF-7细胞后,Bax、Caspase-3、Caspase-8基因表达水平比对照组分别升高28％～54％、13％～49％、21％～70％,BAX、CASPASE-3、CASPASE-8蛋白表达水平比对照组分别升高28％～61％、40％～48％、31％～84％.DEHP染毒3β-HSD高表达细胞后,Bax、Caspase-3、Caspase-8基因表达水平比对照组分别升高39％～75％、22％～30％、32％～45％,BAX、CASPASE-3、CASPASE-8蛋白表达水平比对照组分别升高8％～33％、19％～32％、10％～21％.结论 本文成功构建3β-HSD基因高表达细胞株; DEHP可引起MCF-7细胞和3β-HSD高表达细胞凋亡基因及蛋白发生改变,本文结果提示3β-HSD基因在一定程度上促进DEHP的致凋亡作用.
关键词： 分子克隆 基因高表达 3β-羟类固醇脱氢酶 邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯 凋亡
