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miR-939-5p调控USP22基因表达对肝癌迁移和增殖的影响
目的 探讨miR-939-5p对泛素特异肽酶22(USP22)基因表达的调控作用及对肝癌迁移和增殖的影响.方法 采用荧光定量PCR (qPCR)检测肝癌细胞株(HepG2、MHCC-97H、SMMC-7721、BEL-7404和Huh7)和正常肝细胞株LO2中miR-939-5p的表达.以表达量低的肝癌细胞为实验对象,转染miR-939-5p(实验组)或miR-NC(对照组).qPCR检测miR-939-5p的转染效率.Transwell迁移实验和四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)增殖实验检测miR-939-5p对肝癌细胞迁移和增殖能力的变化.生物信息学软件预测miR-939-5p的靶基因.双荧光素酶报告基因验证miR-939-5p与靶基因的相互作用.qPCR和Western blotting检测高表达miR-939-5p后靶基因在mRNA和蛋白水平的表达.计量数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用t检验.结果 肝癌细胞株中miR-939-5p的表达均明显低于正常肝细胞(P＜0.01),SMMC-7721细胞中miR-939-5p的表达低(P＜0.01).miR-939-5p可有效转染进入SMMC-7721细胞内[(1.01±0.07)比(20.12±1.27),P＜0.01].高表达miR-939-5p可抑制肝癌SMMC-7721细胞的迁移能力(P＜0.01)和增殖能力(P＜0.05).USP22基因可能为miR-939-5p的靶基因.荧光素酶报告基因证实miR-939-5p能与USP22 mRNA的3'-UTR特异性结合(P＜0.01).高表达miR-939-5p后USP22在mRNA和蛋白水平上表达降低(P＜0.01).结论 miR-939-5p在肝癌细胞株中表达降低,可抑制肝癌SMMC-7721细胞的迁移和增殖能力,其分子机制为靶向干扰USP22基因的表达.
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泛素特异肽酶22基因通过Myc调控人膀胱癌EJ细胞增殖的机制研究
目的 研究非对称小干扰RNA(asymmetric structure of interfering RNA,aiRNA)沉默泛素特异肽酶22(ubiquitin specficpeptidase 22,USP22)基因对膀胱癌EJ细胞增殖的影响及其相关机制.方法 2010年8月至2012年3月,我们设计并合成USP22 aiRNA及阴性对照aiRNA(NC-aiRNA) USP22 aiRNA序列结构包括长度分别为15 bp和21 bp的正义链和反义链,将此aiRNA命名为USP22 aiRNA(15/21),利用脂质体转染膀胱癌EJ细胞.实验分3组:对照组、NC-aiRNA组和USP22 aiRNA(15/21)组转染后48 h,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法分别检测USP22、Myc、cyclin D1和cyclin E1基因mRNA和蛋白表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测EJ细胞的增殖活性,荧光素酶报告基因检测系统检测Myc启动子活性 利用染色质免疫共沉淀法(chromatin immunoprecipitation,ChIP)分析沉默USP22基因后转录因子Sp1与Myc基因启动子的结合情况结果 与对照组相比,转染USP22 aiRNA(15/21) 48 h后EJ细胞中的USP22、Myc、cyclin D1和cyclin E1的mRNA和蛋白表达水平分别下调了(87.4±5.2)％和(91.2±7.3)％、(69.2±4.3)％和(61.0±6.6)％、(78.5±4.1)和(67.4± 5.5)％、(81.0±5.5)％和(78.3±4.0)％(P＜0.05).MTT结果显示,USP22aiRNA(15/21)组EJ细胞的增殖活性明显受到抑制,在24、48、72和96h4个时间点的细胞生长活性分别为(85.4±5.7)％、(71.3±8.4)％、(52.5±6.7)％和(45.8±6.4)％(P＜0.05).荧光素酶报告基因检测结果显示,USP22 aiRNA(15/21)组Myc启动子的转录活性下调(65.5±4.2)％(P＜0.05).ChIP结果进一步显示,沉默USP22抑制了转录因子Sp1与Myc启动子的结合,USP22 aiRNA(15/21)组Sp1与Myc启动子的结合能力相比对照组下调了(48.0±3.2)％(P＜0.05).结论 USP22 aiRNA(15/21)可能通过抑制Myc基因启动子与转录因子Sp1的结合,下调Myc的表达,从而抑制膀胱癌EJ细胞的增殖.
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miR-34b抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖
目的:探讨微RNA-34b(microRNA-34b,miR-34b)对人膀胱癌BIU-87细胞增殖的影响及其可能的作用机制.方法:应用实时荧光定量PCR检测膀胱癌BIU-87细胞、人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1和人肾小管上皮细胞HK-2中miR-34b的表达水平.将miR-34b mimic转染至BIU-87细胞后,应用MTT法和克隆形成实验检测BIU-87细胞的增殖和克隆形成情况.miR-34b mimic与泛素特异肽酶22(ubiquitin-specific peptidase 22,USP22)-野生型(wide type,WT)或USP22-突变型(mutation type,Mut)重组载体共转染后,应用萤光素酶报告系统检测miR-34b是否与USP22基因3'-非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)结合.应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测miR-34b mimic转染后,BIU-87细胞中USP22 mRNA和蛋白的表达水平.结果:膀胱癌BIU-87细胞中miR-34b的表达水平低于肾小管上皮细胞HK-2和膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1 (P值均＜0.05).miR-34bmimic转染后,BIU-87细胞的增殖率和克隆形成率低于空白对照组(BIU-87细胞未进行任何转染)和阴性对照组[BIU-87细胞转染miRNA mimic negative control (miRNA mimic NC)](P值均＜0.05).萤光素酶报告系统检测结果显示,miR-34b能特异性地与USP22基因3'-UTR结合,miR-34b mimic与重组载体USP22-WT共转染组细胞的萤光素酶活性下降(P＜0.05).miR-34b mimic转染组BIU-87细胞中USP22蛋白的表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P值均＜ 0.05).结论:miR-34b可抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖,这一作用可能与USP22的表达有关.
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USP22aiRNA通过Mdm2-p53通路抑制膀胱癌耐药细胞株T24/MMC的增殖
目的 研究沉默泛素特异肽酶22(USP22)基因对膀胱癌T24丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)耐药细胞株(T24/MMC)生长活性的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 采用MTT法检测不同浓度的MMC(20、40、80、160、320μg/mL)对T24和T24/MMC细胞生长活性的影响.实时荧光定量PCR和Western blot法检测人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1细胞株、T24和T24/MMC细胞中USP22 mRNA和蛋白的表达水平.采用非对称性小RNA(aiRNA)干扰技术沉默USP22,MTT法和吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)双重染色法分别检测沉默USP22后MMC对T24细胞、T24/MMC细胞生长活性和凋亡的影响.实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测p53和Mdm2 mRNA和蛋白的表达水平.结果 采用不同浓度的MMC(20、40、80、160、320 μg/mL)处理细胞24 h后,T24细胞的生长活性分别为82.4％、68.7％、44.2％、25.4％和4.7％,与未经MMC处理组比较差异均具有统计学意义(均P＜0.05).然而,0～160μg/mL的MMC对T24/MMC细胞的生长活性无明显影响.与SV-HUC-1细胞比较,USP22在T24及T24/MMC细胞中高表达,且T24/MMC细胞中USP22表达显著高于T24细胞,差异具有统计学意义(P＜0.05).沉默USP22后,MMC对T24细胞的生长活性抑制作用更显著.且当MMC浓度在20～160 μg/mL时,沉默USP22后T24/MMC细胞的生长活性也明显受到抑制,其生长活性分别为85.1％、70.3％、63.2％和47.8％.同时,AO/EB实验结果显示,沉默USP22后给予80 μg/mL的MMC处理24 h,可诱导T24及T24/MMC细胞凋亡.实时荧光定量PCR和Western blot结果进一步显示,转染USP22 aiRNA 24 h后,T24/MMC细胞中p53基因的mRNA和蛋白表达水平上调,Mdm2表达水平下调.结论 USP22 aiRNA通过调控Mdm2-p53通路增强MMC抑制T24细胞增殖的敏感性,同时也能够逆转T24/MMC对MMC的耐药.
