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C型凝集素在结核病发病机制中的作用
C型凝集素(G-type lectina)是一类非酶、非抗体蛋白质,其活性依赖于Ca~(2+),以跨膜蛋白和水溶性蛋白两种形式存在.C型凝集素的共同结构特征是具有1个或多个糖识别域,能选择性识别并结合病原微生物的糖结构域.C型凝集素根据糖识别域1级结构的不同可分为蛋白聚糖、I型跨膜受体、Ⅱ型跨膜受体、胶原凝集素、选凝素及自然杀伤细胞受体6个家族,其中胶原凝集素、I型跨膜受体和Ⅱ型跨膜受体与结核病的发病机制密切相关.
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抗MBL单抗1C8对人单核-巨噬细胞调理吞噬功能的影响及其机制
甘露聚糖结合凝集素(MBL)通过激活补体凝集素途径而发挥间接调理作用.本研究探讨了抗人MBL单抗1C8对凝集素途径介导人单核-巨噬细胞调理功能的影响及其机制.采用流式细胞术和荧光显微镜观察,发现1C8能抑制人单核细胞和巨噬细胞对白色念珠菌的吞噬；通过凝集试验观察到,1C8能阻断重组人MBL糖识别域蛋白(rhMBL-CRD)介导的白色念珠菌、大肠杆菌凝集；ELISA和western blot分析结果显示,1C8特异性地与rhMBL-CRD结合,这种结合可被甘露聚糖、D-甘露糖胺和D-葡糖胺等阻断.结果表明,1C8通过结合糖识别域,竞争性抑制MBL与微生物表面糖结构的结合,进而阻断补体凝集素途径的活化,从而发挥对单核巨噬细胞调理吞噬的抑制作用.
关键词： 抗MBL单抗(1C8) 单核巨噬细胞 调理吞噬 糖识别域 -
Balb/Cdx鼠甘露聚糖结合凝集素-A糖识别域的原核表达
目的 获取具有生物学活性的Balb/C小鼠血清型甘露聚糖结合凝集素(MBL-A)糖识别域(CRD)蛋白.方法 应用PCR从含Balb/C小鼠MBL广A基因的质粒pmMBL-A中扩增目的 基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的 蛋白.表达产物(包涵体)经洗涤和复性处理后,利用GST柱纯化,以SDS-PAGE、Western blotting和ELISA进行分析鉴定.结果 从pmMBL-A中扩增到约450 bp的DNA片段,构建重组载体pET41a-mMBL-A-CRD,经酶切和测序鉴定后,将其导人大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物主要以包涵体形式存在,其相对分子质量约47 000.包涵体经洗涤及复性处理,GST柱纯化后,融合蛋白的纯度达90%以上.Westemblotting显示重组融合蛋白与抗GST抗体特异性反应,糖结合试验表明表达产物具有生物学活性.结论 成功获得了具有生物学活性的Balb/C小鼠MBL-A CRD蛋白,为MBL-A分子的研究奠定了一定基础.
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人MBL糖识别域在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定
目的原核表达重组人甘露聚糖结合凝集素(MBL)糖识别域(CRD).方法采用PCR技术,从含汉族人MBL全长编码区cDNA的重组质粒pGEM-mbl中扩增出CRD包括颈区的基因片段,将其插入原核表达载体pGEX-4T1中,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中表达.包涵体经变性、复性后以GSTtrap亲和层析柱纯化,融合蛋白经凝血酶切割后回收目的蛋白.分别以Western blot和ELISA分析表达产物的免疫学和糖结合活性.结果 PCR扩增得到长约450bp的目的基因片段,插入pGEX-4T1载体所获重组表达载体pGEX4T1-CRD的酶切图谱和序列与预期的一致.重组子经诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在.以GSTtrap亲和层析柱纯化获得约Mr43000的GST-CRD融合蛋白,经凝血酶切割后得到约Mr17000的CRD蛋白.纯化的GST-CRD蛋白能与抗人CRD单克隆抗体特异性结合并具糖结合活性.结论获得了具生物学活性的人MBL CRD蛋白,为进一步探索MBL分子CRD的效应功能提供了实验材料.
