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Ad-VEGF165转基因成纤维细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及其分子机制研究
目的 研究经腺病毒介导的人血管内皮生长因子165(VEGF165)转基因细胞修饰的再生丝素膜(SF)诱导血管形成活性及其分子机制.方法 将WI-38人胚肺成纤维细胞分别培养在有(SFC组)或无(PBS组)再生丝素膜的24孔培养板上,24 h后用带绿色荧光蛋白(GFP)基因的空载体腺病毒Ad-GFP(Ad-GFP组/SFCG组)或含有VEGF165目的 基因的重组腺病毒Ad-VEGF165(Ad-VEGF165组/SFCV组)感染培养细胞.通过形态学观察和ELISA法检测各组细胞培养上清液中VEGF165目的 基因表达及其对细胞自分泌的血管生成素-1(Ang-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)、血小板衍化生长因子(PDGF)表达的影响,并用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)和在兔眼角膜上进行新生血管诱导实验.结果 形态学观察发现WI-38细胞在再生丝素膜上不仅贴壁生长良好,而且易被Ad-GFP、Ad-VEGF165腺病毒感染,呈现强荧光.再生丝素膜利于Ad-VEGF165组中VEGF165目的 基因在细胞中的高表达(P＜0.05),而且还可使细胞自分泌的Ang-1表达水平明显升高(P＜0.05),同时可维持细胞自分泌的FGF2及PDGF稳定表达.Ad-VEGF165组(SFCV组)具有促进CAM上血管生长活性和诱导兔眼角膜组织新生血管生成作用.结论 Ad-VEGF165感染WI-38成纤维细胞所修饰的再生丝素膜,具有诱导血管新生的功能.
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再生丝素膜对Ad-VEGF165转基因成纤维细胞基因表达的影响
背景:前期实验已证实再生丝素膜可促进pcDNA3.0-VEGF165转染的L929细胞表达血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF).目的:进一步观察再生丝素膜对经腺病毒介导的人VEGF(Ad-VEGF165)转基因成纤维细胞基因转录表达的影响.设计、时间及地点:对比观察细胞基因工程实验,于2007 11/2008-04在苏州大学细胞与分子生物实验室完成.材料:再生丝素膜由苏州大学材料工程学院李明忠教授提供.方法:将Ad-VEGF165腺病毒感染培养在再生丝素膜、聚氯乙烯膜及聚乙烯膜卜的QBI-293A人胚肾和WI-38人胚肺成纤维细胞,以空载体Ad-GFP腺病毒和未接种病毒的PBS组为对照.主要观察指标:通过实时定量RT-PCR法检测不同材料对成纤维细胞VEGF mRNA转录的影响;ELISA法检测其埘VEGF、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子表达的影响.结果:再生丝素膜组成纤维细胞VEGF mRNA呈高水平表达,但聚氯乙烯膜组转录水甲明显下降(p<0.05).再生丝素膜组Ad-VEGF165转基因293A细胞及WI-38细胞小仅日的基因VEGF细胞因子的分泌旱高水平表达,并可促使血管生成素1基因表达水平明显提高(P<0.05),而R再生丝素膜还可使成纤维细胞自身分泌的碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子呈现正常表达水平.结论:再生丝索膜不仪利于VEGF目的基因在成纤维细胞中呈现高效表达,并促进血管生成素1基因的表达,而且能维持成纤维细胞自身分泌的与组织损伤修复相关基因碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子的正常表达.
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Ad-Ang-1转基因成纤维细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及其分子机制研究
目的 研究经腺病毒介导的人血管生成素-1(Ad-Ang-1)转基因细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成活性及其分子机制.方法 将Ad-Ang-1腺病毒病毒子感染再生丝素膜上培养的WI-38人胚肺成纤维细胞,通过ELISA法检测再生丝素膜对成纤维细胞目的 基因表达的影响,将Ad-Ang-1转基因WI-38细胞修饰的丝素材料进行鸡胚尿囊膜血管形成实验(CAM)和兔角膜层间植入诱导角膜新生血管试验,并用ELISA法检测其对血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)、血小板衍化生长因子(PDGF)表达的影响.结果 Ad-Ang-1可感染再生丝素膜上培养的成纤维细胞,ELISA法检测结果表明SF组Ad-Ang-1转基因WI-38细胞可以成功表达目的 基因 (P<0.05).CAM实验表明Ad-Ang-1转基因WI-38细胞修饰的再生丝素膜具有促进CAM血管生成的活性,并通过兔角膜层间植入实验进一步证明Ad-Ang-1转基因细胞修饰的丝素材料具有诱导角膜组织血管生成的作用,其机制可能与再生丝素膜对Ad-Ang-1转基因的WI-38成纤维细胞中不仅可以成功表达目的 Ang-1,而且还可使与血管生成和组织损伤修复相关的VEGF、FGF2、PDGF基因表达水平明显提高有关.结论 Ad-Ang-1转基因细胞修饰的丝素材料具有诱导血管生成的作用,为今后进一步采用转基因技术对生物材料进行修饰或改性、研制出具诱导性的医用生物膜材料创造了条件.
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人胰岛素样生长因子-1基因强化组织工程法诱导裸鼠异位软骨形成
目的 探讨人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因转染诱导后的人骨髓基质干细胞(hMSCs)与再生丝素膜复合后在裸鼠体内形成组织工程软骨的能力.方法 分离培养hMSCs,体外诱导成软骨样细胞,流式细胞仪测定细胞表型,免疫组化检测软骨细胞表型;脂质体介导hIGF-1转染诱导后的hMSCs, RT-PCR、酶免疫测定法和免疫组化检测hIGF-1及Ⅱ型胶原的表达;转染后的hMSCs与再生丝素膜复合培养,扫描电镜观察细胞形态,复合物植入裸鼠皮下,HE及免疫组化染色观察新生软骨的结构和表型.结果 分离培养出纯化的hMSCs符合间充质干细胞表型,具有快速增殖及经诱导后向软骨分化的能力,诱导后的细胞表达Ⅱ型胶原;转染诱导后的hMSCs能稳定分泌具活性的hIGF-1蛋白,并表达软骨细胞表型;转染后的hMSCs与再生丝素膜复合培养显示良好的生物相容性,新生组织具典型的软骨组织陷窝,并表达Ⅱ型胶原.结论 经hIGF-1基因诱导后的hMSCs与再生丝素膜在体内能构建出软骨样组织.
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再生丝素膜对VEGF基因转录表达影响的实验研究
作为一种将被用作创面修复的医用生物材料,丝素蛋白是否影响血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的转录表达是一个值得关注的问题.本研究通过对ECV304细胞在再生丝素膜上形态学观察和生长曲线的测定,以及采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)证实再生丝素膜不影响ECV304细胞的生长和功能的正常发挥.转入人VEGF基因的L929细胞在再生丝素膜上生长,ELISA检测和实时定量RT-PCR (Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction, Real-time quantitative)证实了再生丝素膜不影响该转基因细胞VEGF基因的转录与表达.再生丝素膜对组织修复过程中诱导血管生成无任何不良影响,是一种安全有效的医用生物材料.
关键词： 丝素蛋白 再生丝素膜 血管内皮生长因子 实时定量RT-PCR
