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shRNA沉默MRE11表达对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU DNA损伤修复的影响
目的:观察shMRE11沉默MRE11基因对肝癌耐药细胞Be17402/5-FU DNA损伤修复功能的影响.方法:采用阳离子脂质体法将shMRE11干扰质粒转染BEL7402/5-FU细胞,Rea1-time PCR及Western blot检测沉默效率；Western blot检测细胞γ-H2AX蛋白表达；EdU法检测细胞DNA合成;MTT法检测细胞增殖情况.结果:Real-time PCR及Western blot检测结果显示MRE11 mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为78.0％、56.1％; Western blot检测γ-H2AX表达结果显示shMRE 11实验组(1.04±0.056)较对照组(0.847±0.025)增加(P＜0.05,t=10.78);EdU检测结果显示shMRE11实验组DNA合成率(38.819％±2.607％)较对照组(49.814％±1.227％)降低(P＜0.05,f=-8.87); MTT细胞增殖检测结果显示转染72 h后shMRE 11实验组(0.58±0.08)与对照组(0.87±0.09)相比细胞增殖速度减慢(P＜0.05,t=-50.2).结论:shMRE11干扰质粒能够有效抑制BEL7402/5-FU细胞中MRE11表达,使细胞DNA损伤修复能力减弱、抑制细胞增殖.
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半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺递送siRNA对肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中MRE11表达的影响
背景:壳聚糖是一种常用的非病毒载体,具有良好生物相容性、生物可降解性、低毒等优点,但其基因递送能力相对较弱,常需要进行结构衍生修饰.目的:观察半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺(LA-CS-PEI)在肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中递送siRNA的能力及对减数分裂重组蛋白11(MRE11)表达的影响.方法:①将肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu或人肝细胞HL-7702分别与0,10,20,40,80,100 mg/L的LA-CS-PEI或壳聚糖-聚乙烯亚胺共培养24 h,检测细胞存活率;②将LA-CS-PEI与siRNA-FAM分别以0,2,4,8,16,32的质量比混合,制备复合转染颗粒.以复合转染颗粒转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu,48,72,96 h后,以转染效率筛选佳质量比与转染时间,进行下步实验;③以复合转染颗粒、LA-CS-PEI、siRNA分别转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu 48 h后,以未转染的细胞为空白对照,检测MRE11基因及蛋白的表达.结果与结论:①与壳聚糖-聚乙烯亚胺相比,LA-CS-PEI毒性更低,且当LA-CS-PEI质量浓度高达100 mg/L时,仍表现出很低的细胞毒性;②LA-CS-PEI与siRNA-FAM质量比为4和8时转染效率均达95%以上,入胞效率极高,转染48 h转染效果好,所以后续实验选择质量比为8,转染时间为48 h的复合转染颗粒;③复合转染颗粒组MRE11基因及蛋白表达低于LA-CS-PEI组、siRNA组、空白对照组(P<0.05);④结果表明,LA-CS-PEI能实现siRNA的有效递送,并能沉默肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中的MRE11基因.
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PEI-CS/siRNA复合颗粒对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU中MRE11表达的影响
目的:探讨聚乙烯亚胺-壳聚糖(PEI-CS)/siRNA复合颗粒对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU中MRE11表达的影响.方法:采用复凝聚法将PEI-CS(100 μg/mL)与不同浓度的MRE11 siRNA-FAM形成PEI-CS/siRNA复合颗粒,并转染BEL7402/5-FU细胞,用荧光显微镜和Real-time PCR检测转染效率和沉默效率.结果:荧光显微镜观察结果显示:转染细胞48h后,3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL的siRNA与PEI-CS形成的复合颗粒的转染率分别为62.31％、76.09％、79.99％、86.49％、96.59％.转染细胞48、72、96 h后,12.5 μg/mL的siRNA与PEI-CS形成的复合颗粒的转染率分别为78.22％、55.76％、42.85％,25 μg/mL的siRNA与PEI-CS形成的复合颗粒的转染率分别为83.67％、74.23％、67.45％.Real-time PCR检测结果显示:25 μg/mL的siRNA与PEI-CS形成的复合颗粒转染48小时后,对BEL7402/5-FU细胞中MRE11基因的沉默效率为35.4％.结论:聚乙烯亚胺-壳聚糖/siRAN复合颗粒能有效转染肝癌耐药细胞Be17402/5-FU,并对BEL7402/5-FU细胞中MRE11基因表达有一定抑制作用.
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MRE11沉默对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU增殖和凋亡的影响
目的:观察shMRE 11对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU细胞增殖和凋亡的影响,初步探索MRE 11与肝癌发生发展的关系.方法:采用阳离子脂质体法将shMRE 11干扰质粒转染BEL7402/5-FU细胞,Real-time PCR及Western blot检测沉默效率;MTT法检测转染前后BEL7402/5-FU细胞增殖情况;AnnexinV-FITC/PI双染法检测MRE 11基因沉默对BEL7402/5-FU细胞凋亡的影响.结果:Real-timePCR及Western blot检测结果显示MRE11 mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为78.0％、56.1％.MTT结果显示,shMRE11转染BEL7402/5-FU细胞后,shMRE 11实验组与对照组相比细胞增殖速度减慢(P＜0.05).AnnexinV-FITC/PI双染法检测结果显示shMRE11实验组的细胞凋亡指数增高,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:shMRE 11干扰质粒能够抑制BEL7402/5-FU细胞增殖,促进细胞凋亡.
关键词： 肝肿瘤 减数分裂重组蛋白11 RNA干扰 BEL7402/5-FU 细胞增殖 细胞凋亡 -
shMRE11质粒转染对BEL7402/5-FU肝癌细胞耐药性的影响
目的 研究减数分裂重组蛋白11(MRE11)基因沉默对5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的肝癌细胞株Bel7402/5-FU的化疗敏感性及耐药相关蛋白1(MRP1)表达的影响,探讨MRE11与肝癌耐药性的关系.方法 采用阳离子脂质体法将shMRE11干扰质粒转染BEL7402/5-FU细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)及Western blot法检测沉默效率；MTT法检测转染后BEL7402/5-FU细胞对化疗药物顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)、5-FU的敏感性,qRT-PCR及Western blot法分别检测转染后BEL7402/5-FU细胞中耐药相关蛋白MRP1 mRNA水平及蛋白水平的变化.结果 qRT-PCR及Western blot法检测显示MRE11mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为78.0％、56.1％.MTT结果显示,shMRE 11转染BEL7402/5-FU细胞后,shMRE11实验组对DDP、MMC、ADM、5-FU的IC50均低于对照组(P＜0.05).qRT-PCR及Western blot法检测结果显示shMRE11实验组MRP1mRNA及蛋白水平的表达与对照组相比均有所降低(P＜0.05).结论 shMRE11能够提高肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU对化疗药物的敏感性,降低耐药相关蛋白MRP1的表达.
关键词： 肝癌 多药耐药 RNA干扰 减数分裂重组蛋白11 BEL7402/5-FU
