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睾丸特异性基因TDRG1在精原细胞瘤中的表达及临床意义
目的 探讨睾丸特异性基因TDRG1在精原细胞瘤中的表达及临床意义.方法 采用免疫组化的方法检测106例精原细胞瘤组织及35例正常睾丸组织中TDRG1的表达,首次对TDRG1与精原细胞瘤患者年龄及肿瘤TNM分期等临床病理参数的相关性进行分析.结果 TDRG1在精原细胞瘤组织中的表达明显高于正常睾丸组织,差异具有统计学意义.TDRG1的表达与TNM分期存在正相关性,与精原细胞瘤患者年龄无相关性.结论 TDRG1可能作为癌基因参与精原细胞瘤的发病,有望为精原细胞瘤提供新的研究思路及可能的治疗靶点.
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人类睾丸基因TDRG1在不同物种间同源序列的克隆及分析
目的 克隆人类睾丸特异基因TDRG1在不同物种间的同源序列,为研究该基因功能寻找动物模型.方法 以人TDRGI基因全长序列作为查询序列,利用BLASTN 软件检索小鼠、大鼠、黑猩猩和猕猴基因组数据库,查询到的同源序列运用RT-PCR实验验证.免疫组化染色初探TDRG1同源蛋白在不同物种间的表达.结果 生物信息学分析表明小鼠和大鼠基因组中未检索到与TDRG1同源的序列,黑猩猩和猕猴基因组中分别有相似性为98%和90%的同源序列存在.RT-PCR验证了猕猴睾丸中的同源序列,免疫组化结果显示抗人TDRG1单克隆抗体能特异结合猕猴睾丸中的同源蛋白.RT-PCR和免疫组化染色也表明小鼠和大鼠睾丸中无同源序列和同源蛋白表达.结论 TDRG1基因在小鼠和大鼠睾丸中无同源基因表达,而在猕猴和黑猩猩睾丸中有同源基因表达,为今后建立动物模型提供了理论依据.
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穿膜肽-TDRG1重组蛋白原核表达载体的构建
构建穿膜肽TAT与TDRG1融合蛋白的原核表达载体.以pYD5-TDRG1载体为模板,设计N端和C端含有flag序列和不同酶切位点的引物,利用PCR技术扩增TDRG1基因片段.同时利用内切酶对已构建好的载体pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT进行酶切处理,再把扩增产物插入已处理好的线性载体pET28a(含有TAT)中,构建成重组质粒pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT,热激转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选,送测序比对验证.PCR扩增出TDRG1基因片段,目的插入片段长约344bp,产物行限制性内切酶酶切后连接到预先酶切处理好的线性载体pET28a上,并成功转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选后挑选阳性克隆抽质粒送测序,测序比对序列完全一致.成功构建了原核表达载体pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT.
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人睾丸特异表达基因TDRG1 shRNA表达载体的构建及其表达
目的:构建人睾丸基因TDRG1的shRNA表达质粒,并研究其在NTERA-2细胞中的表达.方法:设计合成有短发夹结构靶位TDRG1基因的寡核苷酸,经退火成双链,克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中,构建TDRG1shRNA表达载体,得到重组质粒TDRG 1-shRNA486,TDRG 1-shRNA738,TDRG 1-shRNA921和一个阴性对照,使用LipofectamineTM 12000转染shRNA至NTERA-2细胞,应用RT-PCR法检测转染后NTERA-2细胞TDRG1 mRNA的表达水平.结果:经测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致.同时筛选到转染TDRG 1-shRNA486的NTERA-2细胞TDRG1基因的mRNA表达水平明显抑制.结论:成功构建了人类睾丸基因TDRG1的shRNA表达载体,TDRG 1-shRNA在NTERA-2细胞内成功表达.
