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靶向核糖核酸酶在体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究
目的观察HBV靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease,TR)的体外抗病毒作用. 方法将包含HBV核心蛋白(HBVc)和人类嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN)编码基因克隆入pcDNA3.1(-),构建HBV TR重组真核表达载体p/TR.构建包含HBV核心蛋白、人类嗜酸性粒细胞来源的神经毒素以及突变失活的HBV TR编码基因的重组真核表达载体p/HBVc、p/hEDN、p/TRmut (hEDN的Lys113→Arg,失去其RNase活性)作为对照.脂质体转染p/TR、p/HBVc、p/hEDN、p/Trmut、pcDNA3.1(-)进入2.2.15细胞.转染后,RT-PCR证实转染基因的表达,通过观察转染细胞的形态核MTT法检测转基因表达的细胞毒性.用固相放免法测定转染细胞培养上清HBsAg浓度. 结果转基因在2.2.15细胞内都有表达,且对细胞无毒性.与空转染组相比,pcDNA3.1(-)/TR转染组HBsAg含量下降58%;对照各质粒无此变化. 结论 TR在体外可以抑制HBV复制,同时对宿主细胞无毒性.TR可以作为一种新型的抗病毒制剂治疗乙肝病毒感染.
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腺病毒介导的靶向核糖核酸酶抑制HBV复制的研究
目的观察Linker介导的乙型肝炎靶向核糖核酸酶(HBV-TRL)重组腺病毒载体(RAd)对HBC复制的抑制作用.方法使用构建载体pcDNA3.1(-)/TRL、TR、TRmut、乙型肝炎病毒核心蛋白(HBVc)、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN),分别将各目的片段亚克隆入穿梭质粒pDC316,与辅助质粒用磷酸钙法共转染HEK293细胞,分别产生载体RAd/TRL、RAd/TR、RAd/TRmut、RAd/HBVc、RAd/nEDN,其中RAd/TRL组为实验组,其余为对照组.感染HepG2.2.15细胞,应用RT-PCR、间接免疫荧光法检测TRL的表达,放免法测定细胞上清中HBsAg、HBeAg的含量.结果成功获得了含TRL、TR、HBVc、hEDN等不同目的片段的RAd,在HepG2.2.15细胞中得到有效表达,并且明显降低了细胞上清中HBsAg、HBeAg的含量.结论腺病毒载体介导的乙肝靶向核糖核酸酶具有明显的抑制HBV复制的作用.
关键词： 乙型肝炎病毒 核衣壳导向的病毒灭活 靶向核糖核酸酶 腺病毒载体 -
HBV靶向核糖核酸酶真核表达载体的构建及其在2.2.15细胞内的表达
目的构建人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN)与乙肝病毒核心蛋白(HBVc)的融合真核表达载体(该融合蛋白即为构建的靶向核糖核酸酶),抑制乙肝病毒在细胞内的复制.方法分别从HL-60细胞和2.2.15细胞中提取总RNA,用RT-PCR特异性扩增hEDN及HBVc编码基因,将hEDN 和HBVc克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),hEDN克隆入原核表达载体pGEX4T-1,并以纯化的原核表达产物免疫Balb/c 小鼠,制备特异性抗体.用免疫荧光法检验pcDNA3.1(-)/HBVc-hEDN在转染2.2.15细胞内地表达.结果成功地构建了hEDN 和HBVc 的真核融合表达载体,并在2.2.15细胞中较高效地表达.结论 pcDNA3.1(-)/HBVc-hEDN的构建和在2.2.15细胞内的表达,为探索乙型肝炎的治疗开辟了新思路.
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TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白原核载体的构建及表达
目的: 构建蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)TAT和乙肝病毒靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease, TR)融合蛋白的原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达. 方法: 将已构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV core protein, HBVc)基因、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(human eosinophil derived neurotoxin, hEDN)基因, 克隆入含PTD TAT的pTAT原核表达载体, 在大肠杆菌BL21(DE3)LysS 内, 以IPTG诱导融合蛋白表达.表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定.结果: 成功地构建了乙肝病毒靶向核糖核酸酶及其两个对照的融合蛋白原核表达载体, 并在IPTG诱导下获得特异性表达. 结论: Tat-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白的构建, 为体内应用靶向核酸酶治疗乙型肝炎奠定了基础.
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HBV-TR重组腺病毒载体的构建
目的: 构建乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targeted ribonuclease, TR)基因的重组腺病毒载体. 方法: 将HBV-TR基因及其对照组基因分别克隆入质粒载体pDC316得到pDC316/TR等穿梭质粒,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre以磷酸钙法共转染HEK293细胞得到重组腺病毒Ad/TR及对照组重组病毒,并以空斑形成实验(Plaque Assay)测定病毒滴度. 结果: 成功构建了HBV-TR重组腺病毒载体Ad/TR及其对照组病毒并获得了高滴度的病毒颗粒. 结论: HBV-TR重组腺病毒载体成功构建.
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有linker插入的靶向核糖核酸酶抑制乙肝病毒复制
目的: 构建人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN)与乙肝病毒核心蛋白(HBVc)之间插入有linker (Gly4Ser)3的融合真核表达载体(该融合蛋白即为靶向核糖核酸酶),以优化分子折叠,并将其应用于抑制HBV复制的体外研究. 方法: 以第四军医大学病原生物学教研室已构建的pcDNA3.1(-)/TR为基础. 首先合成linker序列,经过退火形成双链并克隆入pcDNA3.1(-)/TR生成pcDNA3.1(-)/HBc-linker质粒;随后hEDN片段经PCR扩增后克隆入pcDNA3.1(-)/HBc-linker质粒生成pcDNA3.1(-)/TNL质粒,其中效应分子(hEDN)与靶向分子(HBVc)之间为linker序列. 应用间接免疫荧光法检测pcDNA3.1(-)/TNL在细胞的表达,并应用放免法测定其抗HBV活性. 同时,应用MTT比色法检测细胞的代谢活性. 结果: 成功构建了有linker (Gly4Ser)3介入的hEDN和HBVc真核融合表达载体;并在HepG2.2.15细胞中得到有效表达. 转染质粒pcDNA3.1(-)/TNL与pcDNA3.1(-)/TR相比可明显地降低HepG2.2.15细胞上清中HBsAg的含量(P<0.05). MTT比色分析表明细胞代谢活性未受到影响(P>0.05). 结论: 将linker插入靶向核糖核酸酶中可增强其对HBV复制的抑制效应.
关键词： 乙肝病毒 Linker 核衣壳导向的病毒灭活 靶向核糖核酸酶
