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PCR指纹图技术筛选鼠疫耶尔森菌种特异性探针的研究
目的利用PCR指纹图技术筛选细菌种特异性探针,探索利用PCR指纹图技术实现病原菌通用检测的可能性. 方法以鼠疫耶尔森菌为实验对象,利用REP-1和REP-2引物对在非严谨的条件下进行PCR指纹图扩增;将所有扩增片段纯化后,克隆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌JM109;用生物素化的载体引物扩增克隆化片段,进行末端标记;在硝酸纤维素膜上固定鼠疫杆菌的染色体DNA以及相应对照菌株的染色体DNA,以末端标记的扩增产物进行杂交,通过生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统显色,判断扩增片段的特异性. 结果经杂交筛选,发现1个长度约为900bp的扩增具有较好的杂交特异性片段,将序列与鼠疫耶尔森菌已完成的基因组序列比较,仅发现4个核苷酸的差异;根据这段序列设计的引物对可以特异性地扩增鼠疫耶尔森菌的模板. 结论利用PCR指纹图技术成功筛选到一段鼠疫耶尔森菌的种特异性探针,为细菌通用检测技术的研究开辟了新的思路.
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聚合酶链反应指纹图HLA-DPB1分型法的建立与验证
为适应从大批无关人群中筛选骨髓供者,依据聚合酶链反应(PCR)杂合双链原理建立了HLA-DPB1 PCR指纹图(PCRF)分型法.该方法不像单链构象多态性聚合酶链反应(PCR-SSCP)那样要求严格的实验条件,只需将PCR产物94℃变性2分钟,37℃复性8分钟,再用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离5小时,经溴乙锭或银染后照相即可完成.用21例由限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)法确定了HLA-DPB1基因型的家系样品的验证表明,21例9种HLA-DPB1基因型中有8种PCRF格局与之对应,除一对外,HLA-DPB1基因型相同者的PCRF格局也相同.认为该方法具有较高的分辨率和特异性,以8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳为佳.
