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肝细胞涂片在评估图像分析仪的精确性和准确性中的应用
多年的肿瘤病理和肿瘤临床研究已经证明,细胞核DNA倍体的异常变化对恶性肿瘤的诊断、疗效估价、预后评估具有重要的指导意义[1-3].图像分析仪已广泛应用于测量和分析肿瘤细胞核DNA倍体[3].目前,我国图像分析仪的生产厂家众多,但至今没有一个统一的国家或学会的技术标准,不可避免地导致国产图像分析仪在质量和性能上存在差异.而使用时缺乏一种简单而有效的方法去检测和评估图像分析仪测量细胞核DNA含量的精确性和准确性.我们对此进行了探讨.
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滤光片对细胞核DNA含量检测的影响
目的 探讨滤光片对图像分析仪测量DNA含量的影响.方法 选取10只成年健康雄性小鼠,制备肝细胞涂片,Feulgen染色和天青B染色,显微镜与摄像机之间分别插入400 nm、560 nm、590 nm、600 nm、626 nm、670 nm带通滤光片和中灰滤光片,利用TIGER细胞图像分析仪测量肝细胞核的积分光密度(IOD)与平均光密度(AOD)和面积.结果 肝细胞核在Feulgen染色法中呈紫红色,天青B染色法呈蓝色.Feulgen染色和天青B染色分别采用560 nm和600 nm的带通滤光片时,能够测得大的IOD值,不同倍体肝细胞核间的比值接近2、4,CV值低.与天青B染色方法相比,Feulgen染色法中不同倍体间的比值更接近2、4,CV值更低.结论 适宜的滤光片可提高细胞核DNA含量测量结果的精确性和准确性.Feulgen染色测量结果精确性和准确性明显高于天青B染色,应作为首选的染色方法.
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光衍射现象对细胞核DNA含量检测的影响
利用图像分析仪测量小鼠肝细胞涂片内单个肝细胞核的DNA含量,探讨图像分析仪在测量显微图像的光度时光衍射现象所导致的测量误差.本文选取10只成年健康雄性小鼠的肝组织涂片,Feulgen染色,TIGER细胞图像分析仪测量单个肝细胞核的DNA含量并分析其DNA含量倍体;结果显示,(1)涂片内肝细胞核分布均匀,轮廓清晰,呈紫红色;(2)不同小鼠同一DNA含量倍体的肝细胞核的DNA含量大致相同;(3)二、四、八倍体肝细胞核的DNA含量比值均大于/[Dept.1]等于2或4,二、四、八倍体肝细胞单个核DNA含量的CV值均小于10%;(4)同一小鼠不同DNA含量倍体肝细胞核的平均光密度值差异较小.结论:光衍射现象可导致DNA含量的测量结果偏低,其偏低的程度随待测细胞核的面积增加而减小.
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染色质浓缩对细胞核DNA含量检测的影响
目的 利用三种不同方法制备小鼠肝细胞涂片,探讨染色质浓缩对图像分析仪测量DNA含量的影响.方法 本文选取10只成年健康雄性小鼠,采用传统涂片、液基制片法和甲醛固定后液基制片法制备小鼠肝细胞涂片,Feulgen染色,TIGER细胞图像分析仪分别测量三种涂片内肝细胞核的积分光密度、平均光密度和面积.结果 三种涂片内肝细胞核分布均匀,轮廓清晰,呈紫红色,与传统涂片法相比,液基法内肝细胞核面积明显减小,染色质高度浓缩;相同倍体的肝细胞核在传统涂片中面积大,平均光密度低,各倍体间的比值接近2和4,积分光密度CV值低(＜3.5).固定法和液基法平均光密度明显升高,各倍体间比值明显偏离2和4,积分光密度CV值＞6.结论 不同制片方法可导致同一类型、处于相同功能状态的细胞核染色质浓缩程度产生明显差异,染色质浓缩可导致平均光密度值升高,积分光密度值降低,测量结果的精确性和准确性降低.
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两种染色方法在细胞核DNA含量检测中的应用及比较
目的 探讨改良、快速两种Feulgen染色方法达到佳染色效果的水解时间段,为科研和临床的应用提供方法学指导.方法 选取5只成年健康雄性SD大鼠的肝组织,制成肝细胞涂片,分别在室温和60℃温度下水解不同时间,应用改良和快速两种方法染色,TIGER图像分析仪检测和分析单个肝细胞核的DNA含量.结果 (1) 不同大鼠肝细胞涂片在同一水解温度、时间作用下,相同DNA倍体含量肝细胞的DNA含量大致相同,CV值均小于10%;(2) 二、四、八倍体肝细胞核的DNA含量比值均接近2或4;(3) 同一大鼠相同水解温度不同水解时间,同一倍体的肝细胞核DNA含量存在差异:60℃水解温度下,IOD(5～7 min)＞IOD(9～15 min)＞IOD(1 min,20 min),室温水解温度下,IOD(50 min)＞IOD(20～30 min,70～90 min)＞IOD(5～1 min,100 min).结论 HCL水解肝细胞涂片时间过长或过短均不能理想的染色,快速法和改良法Feulgen染色达较佳染色效果的时间段分别为:快速法5～7 min,改良法20～90 min.
