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单倍体相合骨髓移植小鼠GVHD靶器官的器官特异性T细胞受体克隆谱型的分子特征
本课题通过单倍体相合骨髓移植小鼠模型,研究GVHD靶器官的器官特异性T细胞受体谱型特点,以及GVHD靶器官克隆性T细胞的TCRBV CDR3分子特征.建立单倍体相合异基因移植小鼠GVHD模型.应用RT-PCR扩增小鼠肝脏、皮肤、回肠等组织移植前后TCRBV 20个家族的基因序列,通过基因扫描判断TCRBV家族的克隆表达、CDR3克隆性质.对于寡克隆表达的TCRBV家族在长泳道测序胶上电泳,对部分单克隆条带测序,得到一组肝脏、皮肤、回肠在移植后不同时间与GVHD相关的TCRBV CDR3的分子.结果表明:单倍体相合骨髓移植小鼠在移植后14天临床开始出现典型的GVHD表现.移植后受鼠肝脏、皮肤、远端回肠等均出现典型的GVHD病理表现,在其T细胞受体谱型图上出现了分属TCRBV家族的单克隆或寡克隆增生的T细胞.肝脏、皮肤、回肠等GVHD的靶器官中部分克隆性增生的T细胞TCRBV CDR3分子存在一些C'末端保守的CDR3氨基酸基序(motif).结论:单倍体相合异基因移植后发生GVHD的组织可出现T细胞单克隆及寡克隆增生,GVHD相关T细胞克隆共用一些保守的TCRBV CDR3基序,识别类似的抗原.
关键词： 单倍体相合骨髓移植 GVHD T细胞受体β链可变区 CDR3 -
异基因造血干细胞移植后T细胞免疫重建的分子特征
目的 研究异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后细胞免疫重建过程中T细胞克隆的T细胞受体β链可变区互补决定区3(TCRBV CDR3)分子特征.方法 应用RT-PCR扩增24例不同类型白血病患者allo-HSCT后及5名正常供者外周血的TCRBV 24个家族的基因序列,通过基因扫描(Genescan)的方法判断TCRBV家族的克隆表达、CDR3克隆性质及计算β链可变区(BV)家族的利用率.对于寡克隆表达的T细胞克隆进一步电泳,得到单克隆条带并测序,获得一组与移植物抗宿主病(GVHD)或巨细胞病毒(CMV)直接相关的TCRBV CDR3的分子.结果 在移植后2个月至19个月,单倍型骨髓移植的9例患者在6～14个BV家族中有表达,多克隆表达率为33%,其余为单克隆或寡克隆表达.无血缘关系外周血干细胞移植的5例患者在10～15个BV家族中有表达,多克隆表达率为45%.同胞全相合骨髓移植的10例患者在9～16个BV家族中有表达,多克隆表达率为48%.单克隆或寡克隆增生分布在24个不同的BV家族,未见共用的BV家族.单倍型骨髓移植后细胞免疫恢复迟于其他两组.其中2例患者在移植后2个月、移植后3个月检测TCRBV,发现移植后随时间增加BV家族的利用增加,CDR3的多克隆群体增多.得到的23条与GVHD及CMV直接相关的TCRBV CDR3分子,经过生物信息学比较发现,在相同的BV家族内,不同患者中可以出现结构相似的CDR3氨基酸分子,也可以完全不同;不同BV家族的CDR3分子相差较大,未发现共同使用的氨基酸基序.结论 不同类型白血病患者allo-HSCT后19个月内,TCRBV家族的利用仍处于不均一状态.单倍型骨髓移植后细胞免疫恢复迟于其他两组.得到的一组与GVHD及CMV相关的单克隆或双克隆T细胞CDR3分子,在相同的BV家族内,不同患者出现结构相似的CDR3氨基酸分子;不同BV家族的CDR3分子之间未发现共同使用的氨基酸基序.
关键词： 造血干细胞移植 免疫重建 T细胞受体β链可变区 克隆 -
小鼠胸腺输出功能及免疫重建的研究方法
目的 建立实时定量PCR检测小鼠T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环(sjTREC)水平和T细胞受体β链可变区(TRBV)CDR3的方法,推测其中的初始T细胞的数目和克隆性,评价胸腺输出功能及免疫重建,从而为胸腺输出功能及移植后T细胞免疫提供可靠的研究方法.方法 分别提取小鼠脾脏细胞基因组DNA和总RNA.PCR方法扩增DNA标本目的 片段.纯化鉴定并构建含sjTREC片段的质粒标准品.建立稳定的实时定量PCR反应检测小鼠脾脏淋巴细胞sjTREC含量的方法.采用半巢式PCR扩增TRBV基因产物.采用ABI 3700分析TRBV谱型.结果 构建了可靠的sjTREC和TCRα质粒标准品.在实时定量PCR中建立了可靠的标准曲线.建立的定量PCR方法分析可成功用于脾细胞的sjTREC含量的检测.8周龄BALB/c小鼠脾细胞sjTREC含量为(626±115)拷贝/105个脾细胞.结论 建立了可靠的定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTREC含量的方法,建立了分析T细胞谱型的方法,为研究生理和病理条件下胸腺输出功能及T细胞免疫莺建改变提供了可靠的方法.
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单倍型骨髓移植小鼠移植物抗宿主病模型的建立及移植物抗宿主病靶器官T细胞受体克隆检测
目的:建立单倍型骨髓移植小鼠模型,观察单倍型骨髓移植小鼠移植物抗宿主病(GVHD)靶器官的组织病理表现及器官特异性T细胞受体克隆表达.方法:建立单倍型异基因移植小鼠GVHD模型,进行移植前后GVHD靶器官的病理分析,同时应用RT-PCR扩增小鼠肝脏、皮肤、结肠、肾脏等组织移植前、后T细胞受体β链可变区(TCRBV)20个家族的基因序列,通过基因扫描判断TCRBV家族的克隆表达和CDR3克隆的性质.结果:单倍型骨髓移植小鼠在移植后14 d临床开始出现典型的GVHD表现.移植后24 d受鼠肝脏、皮肤、远端回肠等均出现典型的GVHD病理表现,在其T细胞受体谱型图上出现了分属TCRBV家族的单克隆或寡克隆增生的T细胞,而肾脏等非GVHD靶器官中浸润的淋巴细胞为多克隆的T细胞增生.结论:单倍型骨髓移植小鼠在移植后14 d出现典型的GVHD表现,GVHD靶器官出现的T细胞单克隆及寡克隆增生可能与GVHD的发生相关.
关键词： 单倍型骨髓移植 移植物抗宿主病 T细胞受体β链可变区 CDR3 小鼠
