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Rheb在人急性髓系白血病中的作用研究
目的:通过检测Rheb在成人急性髓系白血病患者(AML)骨髓细胞中的表达,探讨Rheb在AML发生发展中的作用.方法:选择27例AML患者和29例特发性血小板减少性紫癜(ITP)初诊患者的骨髓单个核细胞(BMMNC),用实时定量PCR(RT-PCR)方法检测Rheb的表达水平;分析Rheb表达水平与AML患者年龄、分型、融合基因、脾脏肿大、肝脏肿大相关性.比较Rheb高表达组与Rheb低表达组患者生存时间的差异.构建过表达Rheb的HL-60细胞,应用不同浓度阿糖胞苷处理HL-60细胞和过表达Rheb的HL-60细胞,用CCK-8法检测细胞增殖情况并计算IC50.结果:Rheb在AML患者骨髓单核细胞中表达与ITP患者骨髓单核细胞的表达相比较没有明显差异.Rheb高表达患者相对预后较好,对阿糖胞苷治疗敏感.Rheb表达量与患者年龄、分型、融合基因和肝肿大不相关,与脾脏肿大相关(P＜0.05).体外实验表明,在AML细胞系HL-60中过表达Rheb,可以提高细胞对阿糖胞苷敏感性(IC50=0.54 μmol/L).结论:Rheb低表达可以预示不良预后,且与AML患者脾脏肿大相关,对阿糖胞苷治疗不敏感.
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Rheb过表达在白血病细胞株HL-60和K562中的作用
mTOR信号通路是细胞内重要的生命活动枢纽,它通过抑制细胞凋亡,促进细胞增殖来调控细胞生命活动.Rheb可以激活mTOR信号通路,进而参与多种肿瘤的发生发展.本研究以髓系白血病细胞株为研究对象,探讨Rheb在HL-60和K562中的作用及相关机制.本研究利用逆转录病毒技术使髓系白血病细胞株HL-60和K562过表达Rheb;利用Western blot和Real-Time PCR分别检测HL-60和K562细胞中Rheb的蛋白表达水平及mRNA表达水平；利用CCK-8法检测细胞活力；利用Annexin V-PE和7-AAD双染检测细胞凋亡.结果表明:成功构建了Rheb过表达的HL-60和K562细胞株,并发现Rheb过表达可以促进细胞生长；进一步研究发现,Rheb过表达加快细胞进入G2/M期(P＜0.01),但不影响细胞凋亡.结论:Rheb通过加快细胞周期进程促进HL-60和K562细胞增殖.
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Rheb基因研究进展
结节性硬化症的致病基因TSC1和TSC2编码的错构瘤蛋白和结节蛋白具有肿瘤抑制作用,是细胞生长和增殖的重要调节因子.近年来研究发现,TSC1和TSC2调控的下游因子Rheb在结节性硬化症的致病机制中起着重要作用,参与细胞的生长、增殖、分化等重要细胞进程.该文对Rheb在细胞信号转导、调控细胞内氨基酸水平以及细胞周期等方面的分子生物学作用进行综述.
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Rheb的功能及其在血液肿瘤中的作用研究进展
Rheb为GTP结合蛋白，可调控细胞的生长、增殖、凋亡、存活以及自噬等细胞的基本生命活动，其与结节性硬化症和某些肿瘤相关。 Rheb可调控造血干祖细胞的功能，其过表达可促进淋巴瘤生成，在白血病中可检测到Rheb的过表达。法尼基转移酶抑制剂是 Rheb的抑制剂，可通过促进白血病细胞凋亡，抑制白血病进展。此外，法尼基转移酶抑制剂已在血液恶性疾病中进行了Ⅱ／Ⅲ期临床试验，有可能作为药物用于临床。
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Rheb过表达在前体脂肪细胞株3T3-L1分化中的作用
目的:利用前体脂肪细胞株3T3-L1细胞观察mTOR (mammalian target of rapamycin)信号通路中上游调控因子Rheb(Ras homolog enriched in brain)对其分化的影响.方法:利用高表达Rheb的基因重组质粒转染前体脂肪细胞株,3T3-L1.通过蛋白质免疫印迹实验鉴定质粒成功转染细胞后,诱导该细胞脂肪分化.予以分化第8天的3T3-L1细胞油红染色,并检测细胞内甘油三酯的含量.另外,我们用Western blot方法检测脂肪细胞特异性转录因子PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ)和C/EBP-α(CCAAT-enhancer-binding protein-α)的表达情况来研究Rheb在脂肪细胞分化过程中的作用.结果:我们成功构建了高表达Rheb的3T3-L1细胞株,发现高表达Rheb后可以促进脂滴的生成,油红O染色有显著区别,与对照组相比Rheb高表达组的三酰甘油含量明显升高(P＜0.05);C/EBP-α和PPAR-γ等脂肪细胞特异性的转录因子蛋白表达量与对照组相比也均有升高(P＜0.05).结论:Rheb基因作为mTOR通路上游调控因子,可以促进脂肪细胞的分化.
关键词： Rheb mTOR 3T3-L1前脂肪细胞分化 -
mTOR信号通路中上游调控蛋白Rheb在脂肪细胞分化中的作用
目的 观察mTOR信号通路中上游调控蛋白Rheb对脂肪细胞分化的影响.方法 构建Rheb(Ras homolog enriched in brain)的重组质粒(pCAG-Insulator-Rheb),并将其注射到B6小鼠的胚胎内,产生全身高表达Rheb的转基因小鼠.提取怀孕雌鼠第13.5天的胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast cells,MEFs),PCR鉴定基因型之后进行成脂诱导分化.通过检测分化第12天MEFs内三酰甘油的含量、油红O染色的结果、实时定量PCR方法检测脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达情况,来观察Rheb在脂肪细胞分化过程中的作用.结果 成功构建了全身高表达Rheb的转基因小鼠模型,并且检测到在高表达Rheb后,可以促进MEFs内脂滴的生成,三酰甘油含量增高,油红O染色有明显区别,并且脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达量均升高.结论 Rheb过表达以后可以促进脂肪细胞的分化.
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Rheb和Rheb'D60K突变基因重组慢病毒载体的构建、鉴定及其对肝癌细胞凋亡的影响
目的 构建携带Rheb和Rheb'D60K突变基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在MCF-7细胞中的表达效果,观察其对肝癌细胞凋亡的影响.方法 PCR法扩增Rheb和Rheb'D60K突变基因,构建重组质粒LV31-Rheb-WT、LV31-Rheb-D60K,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染HEK-293 FT细胞,包装产生慢病毒颗粒.将病毒感染MCF-7细胞后Western blotting检测Rheb及PS6蛋白的表达；将病毒感染SK-HEP-1细胞饥饿处理后观察其凋亡情况.结果 PCR及测序表明成功构建了LV31-Rheb-WT、LV31-Rheb-D60K重组慢病毒载体.Western blotting结果显示慢病毒LV31-Rheb-WT感染的MCF-7细胞内Rheb下游的PS6蛋白表达多于慢病毒LV31-Rheb-D60K感染的MCF-7细胞.显微镜下慢病毒LV31-Rheb-D60K感染的SK-HEP-1细胞饥饿后凋亡数目多于慢病毒LV31-Rheb-WT感染的SK-HEP-1细胞.结论 本研究成功构建了Rheb和Rheb'D60K突变基因重组慢病毒载体,初步观察到该突变基因重组慢病毒载体可诱导肝癌细胞凋亡,为进一步研究Rheb基因在肝癌发生发展中的作用,进而开展肝癌的临床靶向治疗研究奠定了基础.
