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异硫氰酸苯已酯抑制T细胞白血病Jurkat细胞Wnt/β-catenin信号通路的研究
本研究目的在于探索研究异硫氰酸苯己酯(PHI)在体外对人类T细胞白血病Jurkat细胞Wnt/β联蛋白(catenin)信号通路及组蛋白调控、细胞凋亡和增殖的影响.用MTT方法检测PHI作用后Jurkat细胞的增殖率变化；用流式细胞术观察细胞凋亡；用Western blot观察Jurkat细胞Wnt/β-catenin信号转导通路相关蛋白β-catenin、TCF、c-myc、cyclinD1水平的变化,以及组蛋白甲基化H3K4,H3K9、乙酰化H3,H4的变化.结果表明,PHI可抑制Jurkat细胞增殖,诱导细胞凋亡,呈浓度和时间依赖性,48 h的IC50约为20 μmol/L; PHI处理3h后上调组蛋白乙酰化H3、H4和组蛋白甲基化H3K4,下调组蛋白甲基化H3K9,7h时作用更明显；PHI作用3 hβ-catenin表达水平无变化,7h后Wnt/β-catenin信号转导通路β-catenin及其周期相关基因TCF、c-myc、cyclinDI表达均下降.结论:PHI抑制Jurkat细胞Wnt/β-catenin信号转导通路,调控组蛋白甲基化、乙酰化,从而诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖.
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Tax基因表达细胞系的建立及其生物学活性的初步研究
本研究旨在建立成人T细胞白血病病毒-1(HTLV-1)的tax基因表达细胞系,并对其生物学特性进行初步研究.利用脂质体将真核表达载体pCMV-tax和空载体pCMV-neo-Bam转入T淋巴细胞系(JurkatE 6-1)细胞,用G418筛选出稳定表达tax基因的T细胞系TaxP和表达tax阴性细胞系TaxN.用RT-PCR检测LAT、SLP-76、ZAP-70和NF-kB(p65)mRNA的表达.将pNF-kB-Luc报告基因质粒分别转染入TAX蛋白阳性和空载细胞后,检测细胞内NF-kB的活性.用流式细胞仪检测CD25,CD69分子的表达.结果表明:用G418筛选出稳定转染tax基因的Jurkat细胞株,经检测RNA转录水平获得了tax稳定表达的转染细胞;RT-PCR显示,与TaxN细胞LAT相比TaxP细胞的ZAP-70,SLP-76和NF-kB表达增高(P＜0.05);pNF-kB-Luc报告基因检测显示,TaxP细胞中NF-kB的活化程度明显提高(P＜0.01);流式细胞仪检测显示,TAX能够促进T细胞表面CD69,CD25分子的表达.结论:建立了tax基因表达细胞系,TAX蛋白能够促进T细胞的活化和激活NF-kB通路.
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迷迭香酸通过调控PI3K通路诱导急性T细胞白血病Jurkat细胞自噬和细胞凋亡
目的:探究迷迭香酸(RA)对急性T细胞白血病Jurkat细胞存活的作用及机制.方法:将细胞随机分为Jurkat组、RA(5μmol/L)组、RA(10 μmol/L)组和RA(20μmol/L)组,分别用0、5、10和20 μmol/L的RA处理细胞,CCK8检测培养不同时间的细胞增殖倍数,克隆形成实验检测细胞增殖,流式检测细胞凋亡,免疫印迹检测Beclin1、P62、LC3、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt和mTOR的表达,免疫荧光检测LC3的表达.结果:RA处理细胞4d后,RA(5、10、20 μmol/L)组细胞增殖倍数与Jurkat组比较明显降低,存活细胞数明显减少,细胞凋亡率明显升高;同时与Jurkat组比较,RA(5、10、20 μmol/L)组细胞Beclin1表达水平和LC3Ⅱ/LC Ⅰ的比值明显降低,P62表达水平明显升高,LC3阳性表达与Jurkat组比较也明显减少;此外,RA(5、10、20μmol/L)还能显著降低p-PI3 K/PI3K、p-Akt/Akt的比值和mTOR的表达水平.结论:RA可诱导急性T淋巴白血病Jurkat细胞自噬和细胞凋亡,作用机制可能与抑制PI3K/Akt通路激活有关.
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沉默NRP-1基因对人T细胞白血病Jurkat细胞株增殖与凋亡的影响
目的：探讨RNAi沉默NRP-1基因对人T细胞白血病细胞株增殖与凋亡的影响。方法：将我们前期构建好的pLB-NRP-1／shRNA重组慢病毒质粒，感染至Jurkat细胞中，用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况及化疗药物表柔比星（ EPI）处理后细胞增殖情况；用AV／PI法结合流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期。结果：细胞增殖结果：在48、72、96 h时间点NRP-1／shRNA干扰组的OD值均低于相应对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；细胞凋亡率结果：与对照组比较，NRP-1／shRNA干扰组细胞的凋亡率明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；对化疗药物表柔比星（ EPI）敏感性检测结果：EPI浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4μg／ml时， NRP-1／shRNA干扰组的细胞生长抑制率较相应对照组高，差异皆有统计学意义（ P＜0.05），并且选择IC50进行EPI诱导后，NRP-1／shRNA干扰组的细胞凋亡率明显升高，与对照组比较差异有统计学意义（ P＜0.05）；WB结果显示：与对照组相比，NRP-1／shRNA干扰组Bcl-2蛋白的表达水平明显下降， Bax的表达水平明显升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；细胞周期结果：与对照组比较，NRP-1／shRNA干扰组G0／G1期细胞的比例增高，S期细胞的比例明显降低，差异均有统计学意义（ P＜0.05）。结论：RNAi沉默NRP-1基因可抑制Jurkat细胞增殖，促进其凋亡，提高对化疗药物的敏感性，其机制可能涉及Bcl-2／Bax途径的调节；并可将细胞周期阻滞在G0／G1期，降低细胞的增殖水平，诱导细胞进入凋亡期。
