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犬圆环病毒ORF3基因的克隆及表达载体的构建
目的 克隆犬圆环病毒(Canine circovirus,CanineCV) ORF3基因,制备ORF3的抗体,为研究ORF3的功能奠定基础. 方法 以CanineCV基因组为模板,PCR扩增编码框ORF3全长序列.将ORF3基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pET(28a)-ORF3.重组质粒转化入感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组蛋白ORF3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定. 结果 PCR扩增出CanineCV编码框ORF3片段长度为318 bp.构建的重组质粒pET(28a)-ORF3转化DE3后经IPTG诱导5h,表达分子质量单位(Mr)约为15×103蛋白,与预期相符.Western blot显示重组蛋白能被Anti-His标签抗体识别. 结论 成功构建了pET(28a)-ORF3重组原核表达质粒,并能在大肠杆菌中表达具有免疫反应性的ORF3,为抗ORF3抗体的制备奠定了基础.
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副血链球菌fap1-orf4基因座位编码的ORF3调控Fap1糖基化与成熟的研究
目的 研究副血链球菌fap1-orf4基因座位编码的ORF3是否调控Fap1的糖基化与成熟,并探讨其对副血链球菌黏附功能的影响.方法 采用基因置换技术构建副血链球菌orf3等位基因置换突变株,利用瓦补分析和Western blot检测副血链球菌Fap1的表达水平,并采用全唾液包被的羟磷厌石黏附试验检测副血链球菌的黏附能力.结果 (1)副血链球菌orf3基凶置换突变株VT1774未发生极化;(2)Western blot检测菌株VT1774显示成熟的Fap1(Mr约220×103)被不成熟的Fap1(M,约470 × 103)所取代,互补分析显示VT1774的互补株VT1775能恢复表达成熟的Fap1;(3)菌株VT1774黏附能力显著下降.结论 副血链球菌fap1-orf4基因座位编码的ORF3是Fap1糖基化与成熟所必需的,orf3基因置换导致Fap1成熟障碍与菌株黏附力显著下降.
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SARS冠状病毒Orf3和Orf4的克隆和分析
目的:克隆SARS冠状病毒的Orf3和Orf4两个开放性读框,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析.方法:通过RT-PCR,从SARS冠状病毒基因组中扩增得到特异性片段,利用TA克隆将PCR产物克隆入PUCm-T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析.结果:RT-PCR扩增出的特异产物与预期长度相符,序列分析表明,其核苷酸序列与已发表的SARS病毒的Orf3和Orf4同源性在99%以上.结论:成功克隆SARS冠状病毒Orf3和Orf4两个开放性读框,为表达及功能研究奠定了基础.
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戊型肝炎病毒ORF3及其截短突变体真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达
目的 构建戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)的开放阅读框3(open reading frame, ORF3)基因及其突变体真核表达载体,并在人肺癌细胞系A549中表达.方法 以PUC-HEV为模板,PCR扩增HEV ORF3及其突变体目的片段,插入到真核表达载体pcDNA3.1-Flag中,构建重组质粒pcDNA3.1-ORF3/Flag、pcDNA3.1-△D1-ORF3/Flag、pcDNA3.1-△D2-ORF3/Flag和pcDNA3.1-△P2-ORF3/Flag,并转染A549细胞,利用Western印迹法检测ORF3及其突变体编码蛋白的表达情况.结果 经双酶切和测序鉴定真核表达质粒pcDNA3.1-ORF3/Flag、pcDNA3.1-△D1-ORF3/Flag、pcDNA3.1-△D2-ORF3/Flag和pcDNA3.1-△P2-ORF3/Flag构建正确,在转染A549细胞24 h后,在蛋白水平可以检测到ORF3及其突变体编码蛋白.结论成功地构建了HEV ORF3及其突变体真核表达载体,并在A549细胞中成功表达,为后期研究HEV各ORFs组分功能及其致病机制奠定基础.
