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犬圆环病毒全基因组克隆与序列分析
犬圆环病毒(Dog circovirus,DogCV)是近年来新发现的一种哺乳动物圆环病毒.为研究DogCV中国流行毒株基因组特性和遗传进化,以犬血清样品提取的DNA为模板,采用重叠PCR技术首次获得DogCV中国流行毒株的全基因组序列,命名为JZ98/2014.序列分析表明JZ98/2014全基因组长度为2063nt,编码3个主要开放阅读框:ORF V1(Rep蛋白,303个氨基酸)、ORF C1(Cap蛋白,270个氨基酸)和ORF C2(106个氨基酸).同源性比较显示JZ98/2014与美国、欧洲流行毒株的全基因组序列同源性为82.1 ％-89.5％,而Rep和Cap基因同源性分别为82.1％-89.5％和84.6％-89.1％.遗传进化树分析显示,目前世界流行的DogCV存在多个分支,而JZ98/2014与美国、欧洲流行毒株处于不同分支.
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犬圆环病毒ORF3基因的克隆及表达载体的构建
目的 克隆犬圆环病毒(Canine circovirus,CanineCV) ORF3基因,制备ORF3的抗体,为研究ORF3的功能奠定基础. 方法 以CanineCV基因组为模板,PCR扩增编码框ORF3全长序列.将ORF3基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pET(28a)-ORF3.重组质粒转化入感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组蛋白ORF3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定. 结果 PCR扩增出CanineCV编码框ORF3片段长度为318 bp.构建的重组质粒pET(28a)-ORF3转化DE3后经IPTG诱导5h,表达分子质量单位(Mr)约为15×103蛋白,与预期相符.Western blot显示重组蛋白能被Anti-His标签抗体识别. 结论 成功构建了pET(28a)-ORF3重组原核表达质粒,并能在大肠杆菌中表达具有免疫反应性的ORF3,为抗ORF3抗体的制备奠定了基础.
