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实验感染昆明鼠粪便微小隐孢子虫18SrRNA基因检测
目的探讨隐孢子虫感染的基因检测方法. 方法用分离自人和牛的微小隐孢子虫各1株分别感染2组昆明小鼠,于接种后第6 d、10 d和14 d分别收集每只动物粪便,用显微镜检查,再用Sheather's蔗糖梯度密度离心法纯化卵囊,提取总DNA,对每份DNA样本做100～10-3稀释,然后用PCR对微小隐孢子虫18SrRNA基因进行特异性扩增.结果接受具有活力的1×104个卵囊/只的36只小鼠,均获得感染;阳性样本被扩增出1条500 bp的片段.隐孢子虫感染小鼠粪便样本各稀释度的PCR检测实验结果表明,PCR检测阳性率随模板DNA样本稀释倍数的增加而增高;小鼠感染后第6 d、10 d和14 d 的100 和10-1两个稀释度的PCR检测阳性率低于镜检结果,而10-2和10-3两个稀释度均高于镜检结果. 结论受染昆明鼠粪便内的微小隐孢子虫可通过扩增其18SrRNA基因检出.
关键词： 微小隐孢子虫 聚合酶链反应(PCR) 18SrRNA基因 昆明小鼠 -
以18SrRNA基因为分子标记的微小隐孢子虫系统发育研究
目的 以18SrRNA基因为分子标记对分离自我国人和牛,以及澳大利亚和美国不同宿主来源微小隐孢子虫的系统发育进行探讨.方法 用PCR扩增我国两个虫株的18SrRNA基因片段并进行序列测定,与登录于GenBank的澳、美两国虫株的相应序列进行比对.用M法构建分子系统树进行系统发育分析.结果 分离自我国的小牛虫株(JLC)与GenBank中3个牛源虫株(澳大利亚的C1,美国的UCP和AUCP-1)亲缘关系近,位于系统发育树的同一枝;分离自我国的人源虫株(JSH)与澳大利亚鼠源虫株(M24)同源,共同位于系统发育树的另一枝.结论 本研究中微小隐孢子虫株间亲缘关系的远近似主要由宿主因素决定,而受地理位置的影响较小.
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结膜吸吮线虫病的流行特征及虫种18S rRNA基因鉴定
目的 了解遵义当地结膜吸吮线虫病的流行特征、虫体形态及18S rRNA基因序列.方法 收集2011-2015年遵义医学院附属医院和遵义市航天医院眼科来自遵义当地及周边结膜吸吮线虫人体感染标本及感染病例临床资料,分析感染者性别、年龄、居住地及家养猫、狗等情况对发病的影响.光镜下观察雌、雄虫形态特征;对线虫标本进行18S rRNA基因PCR扩增,产物序列应用MEGA 7.01软件邻接法进行遗传进化分析及与上传美国国家生物信息中心(NCBI)基因库的基因进行比对.结果 共收集当地结膜吸吮线虫人体感染病例25例,资料完整22例.结膜吸吮线虫人体感染总体呈上升趋势,其中2011年2例(9.1%),2012年1例(4.5%),2013年3例(13.6%),2014年10例(45.5%),2015年6例(27.3%).每年8-11月为高发期,5年共有15例感染,发病人群主要是农民或农民工(20例);发病不受年龄限制,年龄小8.5个月,大77岁,30~60岁患者居多(8例);女性多于男性,分别为16、6例;7例患者家中养有狗、猫.光镜下,结膜吸吮线虫体表边缘锐利呈锯齿状,雄虫尾端较尖、向腹面卷曲,有长短交合刺各1根;雌虫尾端较钝,子宫内含幼虫和虫卵.结膜吸吮线虫18S rRNA基因序列与基因库中日本上传的结膜吸吮线虫(AB538282.1)同源性为100%;系统发育分析显示亲缘关系较近,可聚为一支.结论 遵义当地及周边人体感染结膜吸吮线虫病例总体上呈逐年增多态势,发病人群主要是农民或农民工.结膜吸吮线虫18S rRNA基因序列与AB538282.1同源性较高,根据虫体形态及18S rRNA基因序列和遗传特征,临床上有利于虫种的鉴定及流行病学特征分析.
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牛源隐孢子虫上海分离株的巢式PCR鉴定
目的 用巢式PCR鉴定1株自然感染的上海牛源隐孢子虫.方法 改良抗酸染色法检查含隐孢子虫卵囊的牛粪,油镜下观察卵囊形态,测量大小.以牛粪中的隐孢子虫卵囊DNA为模板,根据隐孢子虫18S rRNA序列设计2对引物,巢式PCR扩增日的片段,测序,同源性比对,并运用MEGA4.0软件构建系统发育树.结果 上海牛源隐孢子虫分离株卵囊呈圆形或椭圆形,大小为(5.6±0.49)mm×(5.2±0.51)mm.扩增出的18S rRNA基因片段为812bp.上海牛源隐孢子虫分离株的18S rRNA与巴西的牛隐孢子虫(Cryptospridium bovis,GenBank登录号为151935628)序列一致性为100%,两者在种系发育树上为同一分支,亲缘关系近;与中国青海、蒙古国、美国、突尼斯等地的牛隐孢子虫序列一致性均为99%.结论 上海牛源隐孢子虫分离株为牛隐孢子虫(C. bovis).
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基因扩增检测四种感染人的疟原虫种类、数量的方法
目的 建立对四种感染人的疟原虫种类、数量进行基因检测的方法.方法 根据恶性疟、三日疟、卵形疟、间日疟的18S rRNA基因序列,设计属、种特异性引物和TaqMan探针,用荧光定量扩增反应确定标本中的基因拷贝数,用电泳区别各种疟原虫,并对2份疟疾血样进行榆测.结果 建立的检测方法对疟疾血样进行检测,荧光定量PCR具有良好的反应性,通过电泳能区分检测标本中的疟原虫株.结论 建立的方法能够特异而灵敏地检测出标本中疟原虫的种类、数量,适合疟疚防治榆测的需要.
