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2型猪链球菌天冬氨酸激酶的原核表达及抗原性检测
目的 原核表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2)天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)并检测其免疫原性.方法 对S.suis 2中国强毒株05ZYH33的AK编码基因05SSU1811进行生物信息学分析并设计引物,通过PCR从05ZYH33基因组中扩增目的片段.将目的基因克隆人原核表达载体pET28a,转化E.coli BL21(DE3)后采用IPTG诱导表达日的蛋白,用His亲和层析柱纯化重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.用纯化的重组AK免疫BALB/c小鼠4次,采血,分离血清,采用间接ELISA检测抗体效价,并进行Western blot分析. 结果 构建的重组质粒在宿主菌中高效表达目的蛋白,His亲和层析柱纯化的重组蛋白,能与感染05ZYH33全菌的猪恢复期血清反应.ELISA检测重组AK免疫鼠血清抗体效价为1∶102 400,Western blot显示该抗血清能与重组蛋白反应. 结论 成功制备重组AK蛋白,该蛋白具有抗原性,为进一步研究AK在S.suis2致病过程中的作用奠定了基础.
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红花天冬氨酸激酶基因片段的分离及表达分析
目的 克隆红花种子中的天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)基因并研究其在种子不同发育时期的表达量.方法 根据红花转录组文库注释信息筛选与红花天冬氨酸激酶(CtAK)基因相关的Unigenes,设计引物,以红花种子总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增CtAK基因片段并连接到克隆载体上,经PCR及酶切鉴定,筛选阳性克隆进行测序.同时利用荧光定量PCR技术对其进行基因表达量的分析.结果 克隆了红花CtAK基因的核心片段,分离到486 bp的基因序列.根据CtAK基因片段设计引物,对不同品种不同发育时期红花种子进行荧光定量PCR分析,CtAK基因在红花品种川红1号初花后13d表达量高.结论 系统发育树分析表明,该基因与其他物种的AK基因具有较高的同源性.
