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IL-12修饰的生孢梭菌抗小鼠乳腺癌作用观察
目的 基于实体瘤内部普遍存在缺氧区及生孢梭菌厌氧生长的特性,利用生孢梭菌靶向递送IL-12至肿瘤部位,观察其抗肿瘤效果及其毒副作用. 方法 利用基因工程技术将IL-12 cDNA克隆至大肠埃希菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1并转入生孢梭菌.用ELISA和Western blot分析其IL-12的表达;IFN-γ诱导试验测定其生物学活性;利用小鼠乳腺癌细胞EMT6制备小鼠肿瘤模型,尾静脉注射重组梭菌后观察其抗肿瘤效果及其毒性表现. 结果 ELISA和Western blot显示重组生孢梭菌可分泌IL-12,体外与小鼠脾脏细胞共同培养可以引起IFN-γ的释放.重组生孢梭菌静脉注射到荷瘤小鼠体内后,小鼠血清IFN-γ显著增高,肿瘤萎缩.实验过程中未观察到与IL-12相关的腹泻、体重减轻和死亡等毒性作用. 结论 利用重组生孢梭菌生产的IL-12具有抗小鼠乳腺肿瘤作用,且没有明显毒性.
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重组大肠埃希菌-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1-eIL-12稳定转化生孢梭菌
目的 近些年来,以厌氧芽孢梭菌作为实体瘤基因治疗载体的研究逐渐受到关注.文中用重组人白细胞介素-12(rhIL-12)基因重组大肠埃希菌(E.coli)-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1,并稳定转化生孢梭菌,为增强杀伤肿瘤细胞的研究提供基础.方法 用SOE-PCR法将rhIL-12基因连到厌氧梭菌的内源性β1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-glucanase,eglA)启动子和信号肽之后,构建融合基因eglAp-rhIL-12,将其插入pIMP1,构建重组质粒pIMP1-eIL-12;重组质粒首先在E.coli DH5α内进行鉴定,然后用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,并提取质粒鉴定阳性克隆.结果 酶切和测序结果表明插入到pIMP1内的融合基因eglAp-rhIL-12序列及读框正确;抗生素压力筛选和20多代随机质粒提取酶切鉴定结果表明重组质粒pIMP1-eIL-12已稳定转化生孢梭菌.结论 成功获得重组质粒pIMP1-eIL-12及其生孢梭菌稳定转化株,为以后的抗肿瘤研究奠定了基础.
关键词： 大肠埃希菌-厌氧梭菌穿梭质粒 生孢梭菌 rhIL-12 pIMP1 -
hIL-12及HER2/neuECD修饰的生孢梭菌工程菌的构建及鉴定
目的 构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用.方法 将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之后,得到融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu.将融合基因插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,得到重组质粒pIMP1-ehIL-12和pIMP1-eHER2/neu.将重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α,通过酶切和测序鉴定无误后,再用电穿孔法转化生孢梭菌；利用红霉素抗性筛选阳性克隆,采用菌液PCR和质粒提取鉴定阳性克隆,采用ELISA法对生孢梭菌培养上清中目的产物进行分析.结果 酶切和测序结果表明重组质粒内的融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu序列和读框正确,菌液PCR、质粒提取和ELISA结果显示hIL-12和HER2/neu ECD基因成功修饰生孢梭菌并表达.经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带和表达外源基因.结论 成功获得hlL-12和HER2/neu ECD基因分别修饰的生孢梭菌工程菌株,为进一步的抗肿瘤研究奠定基础.
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重组穿梭质粒pIMP1-eHER2/neu的构建及其生孢梭菌稳定转化株的筛选与鉴定
目的:制备人原癌基因HER2/neu的细胞外区域(ECD)基因修饰的重组生孢梭菌,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法:利用SOE-PCR将HER2/neu ECD基因连接到厌氧菌的内β1,4-葡聚糖酶的启动子和信号肽基因(eglAp)下游,构建融合基因eglAp-HER2/neu；将其插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,构建重组质粒；首先将重组质粒导人大肠杆菌DH5α内并进行鉴定；然后用电穿孔法将重组质粒导人生孢梭菌.利用红霉素抗性筛选重组生孢梭菌；采用菌液PCR鉴定阳性克隆.结果:酶切和测序结果显示,插入质粒pIMP1内的eglAp-HER2/neu融合基因序列及读框正确.菌液PCR结果表明,重组质粒pIMP1-eHER2/neu成功转化生孢梭菌；经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带pIMP1-eHER2/neu.结论:成功制备了重组质粒pIMP1-eHER2/neu生孢梭菌的稳定转化株,为其进一步的抗肿瘤作用研究奠定基础.
关键词： 大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒 生孢梭菌 Her2/neu ECD pIMP1
