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泡球蚴囊液对大鼠肝细胞TGF-βⅡ型受体及Smads信号蛋白表达的影响
目的 观察泡球蚴(Era)囊液对Wistar大鼠肝细胞TGF-βⅡ型受体(TβRⅡ)及信号蛋白Smad2/3、Smad4及Smad7表达的影响.方法 以Wistar大鼠作肝细胞供者,采用胶原酶肝脏原位灌流消化法分离,1×106接种于Ⅰ型胶原铺底35 mm培养皿,无血清培养20 h后,以泡球蚴囊液置换培养液培养2 h,提取蛋白,Western blot检测TGF-βⅡ型受体(TβRⅡ)、p-Smad2/3、Smad4及Smad7在肝细胞的表达.结果 Western blot显示,泡球蚴囊液处理2 h后,大鼠肝细胞内TβRⅡ、p-Smad2/3、Smad4及Smad7分别为4.71±0.73、2.37±0.34、2.08±0.23和0.19±0.05,对照组分别为1.55±0.21、0.42±0.09、0.37±0.07和0.59±0.12,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 泡球蚴囊液对大鼠肝细胞TβRⅡ、p-Smad2/3、Smad4蛋白表达均有上调作用,而对Smad7蛋白表达具有下调作用,提示泡球蚴侵染宿主过程中通过影响TGF-β/Smads信号通路而造成宿主肝损伤.
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TGF-β Ⅱ型受体的RNA干扰抑制肾纤维化
目的:研究针对TGF-βⅡ型受体的RNA干扰质粒对α-SMA表达的抑制作用,探讨RNA干扰TGF-β RⅡ的方法对肾间质纤维化的抑制作用.方法:单侧结扎输尿管方法制备肾间质纤维化小鼠动物模型.分别经输尿管逆行注射a:RNA干扰质粒;b:错配对照质粒;c:空载体;d:生理盐水;e:正常对照.通过western-blot及免疫组织化学方法检测第3、5、10天后肾组织内TGF-βRⅡ、α-SMA,观察其对肾间质纤维化的抑制作用.结果:针对TGF-β RⅡ的RNA干扰质粒,明显抑制肾组织内TGF-β RⅡ、α -SMA表达;几组对照未见相应作用.结论:针对TGF-β RⅡ的RNA干扰质粒,能够抑制肾间质纤维化的发生、发展,可能成为延缓肾功能减退的有效方法.
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RNA干扰抑制TGF-βⅡ型受体的表达
目的:观察针对TGF-βRⅡ的干扰RNA对TGF-βRⅡ表达的抑制作用,探讨RNA干扰TGF-βRⅡ的方法对肾问质纤维化的抑制作用.方法:PCR方法扩增TGF-βRⅡ的cDNA序列,将全长的TGF-βRⅡ cDNA插入pcDNA3中,构建TGF-βRⅡ的真核表达栽体,酶切、测序及间接免疫荧光鉴定;根据TGF-βRⅡ的设计针对TGF-βRⅡ的干扰RNA,构建针对TGF-βRⅡ的RNA干扰质粒pSUPER-TGF-βR Ⅱ并进行酶切及测序鉴定;脂质体介导针对TGF-βR Ⅱ的RNA干扰质粒和TGF-β RⅡ的真核表达载体共转染293T细胞,western-blot检测293细胞内TGF-β R Ⅱ的表达.结果:pcDNA3-TGF-βRⅡ测序结果显示TGF-βRⅡ基因未发生突变.间接免疫荧光检测TGF-βRⅡ在293T细胞内的表达;测序显示RNA干扰质粒pSUPER-TGF-βRⅡ序列正确,RNA干扰质粒明显抑制293T细胞内TGF-βRⅡ的表达.结论:成功构建了TGF-βRⅡ的真核表达载体及针对TGF-βRⅡ的RNA干扰质粒,RNA干扰质粒能够抑制TGF-βRⅡ的表达,为进一步研究针对TGF-βRⅡ的RNA干扰对肾纤维化的预防及治疗作用提供有用工具.
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转化生长因子-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA真核表达质粒的构建及鉴定
目的:针对转化生长因子-β(TGF-β)Ⅱ型受体基因的不同部位,构建不同TGF-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA(shRNA)表达质粒载体,在转录后水平抑制TGF-βⅡ型受体的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率高的克隆.方法:用DNA重组技术将针对人TGF-βⅡ型受体基因不同部位所设计的4对shRNA序列克隆到真核表达质粒 pSilencerTM3.1-H1 neo vector中,构建TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRⅡshRNA1、2、3、4.脂质体介导转染成人原代成纤维细胞,经G418筛选抑制TGF-βⅡ型受体表达的稳定细胞克隆.结果:3个TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRⅡ shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确.RT-PCR、Western blotting均证实3种shRNA重组质粒中pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRⅡshRNA2可明显降低细胞内TGF-βⅡ型受体mRNA峰度及TGF-βⅡ型受体蛋白表达.结论:成功构建了TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencerTM 3.1-H1-TGF-βRⅡ shRNA1、2、3,并筛选出特异而高效的阻断TGF-βⅡ型受体表达的克隆.此实验结果为进一步研究TGF-βⅡ型受体蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础.
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携带TGF-βⅡ型受体及NKG2D融合基因的NK-92细胞生物学特性研究
目的 构建携带TGF-β receptorⅡ(TGF-βRⅡ)胞外段跨膜区及NKG2D胞内段融合基因的NK-92细胞,并检测其生物学特性.方法 通过RT-PCR从人外周血淋巴细胞中扩增出TGF-β receptorⅡ胞外段跨膜区及NKG2D胞内段基因；利用PCR的方法将2段基因融合,并构建含有融合基因的慢病毒穿梭质粒；将该质粒与包装质粒共转染293T细胞,获得慢病毒颗粒并感染NK-92细胞系,筛选出稳定转染的NK-92细胞系；采用流式细胞术检测目的基因在转染后的NK-92细胞系中的表达,用CCK-8的方法检测24 h和48 h时NK-92-TN的存活能力,同时用Transwell的方法检测NK-92-TN的迁移能力.结果 测序表明,成功获得了TGF-βRⅡ胞外段跨膜区与NKG2D胞内段的融合基因；获得了重组慢病毒；通过筛选得到了可稳定表达融合基因的NK-92细胞系,同时NK-92-TN的存活能力和迁移能力要明显优于对照组.结论 成功建立表达TN的NK-92细胞系,并且发现NK-92-TN的存活能力和迁移能力明显优于对照组,从而为NK-92-TN细胞的体内生物学功能的研究工作奠定了基础.
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封闭式负压引流技术治疗糖尿病足对创面组织中TGF-β1及其受体表达的影响研究
目的 探讨封闭式负压引流技术(vaccum sealing drainage,VSD)治疗糖尿病足后,创面组织中TGF-31及其Ⅱ型受体(typeⅡof TGF-β-receptor,TβRⅡ)表达的变化,分析VSD加快创面愈合的机制.方法将2012年5月-2016年5月收治的80例糖尿病足患者纳入研究,随机分为两组(n=40).采用相同基础治疗的同时,VSD组创面给予VSD治疗,对照组给予外用油纱换药治疗.两组患者性别、年龄、病程、体质量、足部溃疡面积以及Wagner分级比较,差异均无统计学意义(P＞0.05),具有可比性.记录两组患者创基准备时间、住院时间;治疗前及治疗后7d时取创面组织行免疫组织化学染色,计算TGF-β1、TβRⅡ表达阳性指数.结果 VSD组患者经1～3次VSD治疗后行植皮术,平均2次;对照组患者经1～6次换药后行植皮术,平均4次.VSD组患者创基准备时间及住院时间均较对照组明显缩短,比较差异有统计学意义(t=-13.546,P=0.036;t=-12.831,P=0.041).两组植皮均顺利成活,创面愈合良好.免疫组织化学染色示,治疗前VSD组TGF-β1、TβRⅡ表达阳性指数分别为5.3±2.4、14.0±2.6,对照组分别为4.4±2.3、14.7±3.1,比较差异无统计学意义(t=1.137,P=0.263;t=1.231,P=0.409).治疗7d后,VSD组TGF-β1、TβRⅡ表达阳性指数分别为34.3±2.9、41.7±3.7,对照组分别为5.8±2.0、18.1±2.5,比较差异有统计学意义(t=-35.615,P=0.003;t=23.725,P=0.002).结论VSD可提高糖尿病足创面组织中TGF-β1、TβRⅡ的表达,促进肉芽组织生长,加快创面愈合.
