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直接PCR法检测血液中伊氏锥虫感染
为建立伊氏锥虫动基体DNA(Kinetoplast DNA,kDNA)的PCR扩增技术,血液直接PCR法检测伊氏锥虫的感染,本文以伊氏锥虫kDNA片段为靶扩增DNA设计引物,确定适PCR反应条件,建立kDNA片段的PCR扩增技术,应用直接扩增缓冲液(Ampdirect)从感染小鼠的滤纸血标本直接PCR检测伊氏锥虫.结果发现,PCR扩增伊氏锥虫kDNA片段分子量为364 bp,能检测的小DNA量是0.06 pg,与布氏锥虫、活动锥虫没有交叉反应.应用直接扩增缓冲液不需进行样本的DNA抽提,直接PCR能检测感染小鼠的早期滤纸血样本,敏感性高于镜检法.本实验建立的直接PCR法检测伊氏锥虫具有较高的敏感性和特异性,方法快捷,可进一步应用于伊氏锥虫病的早期诊断以及现场调查.
关键词： 伊氏锥虫 直接PCR 动基体DNA(kDNA) 血液 -
伊氏锥虫微管结合蛋白p15基因的分子克隆与表达
根据报道的布氏锥虫(Trypanosoma brucei)微管结合蛋白p15(Tb-MAP p15)基因及其3'非翻译区保守序列设计引物,采用PCR法从伊氏锥虫云南水牛株(Trypanosoma evansi stock YNB)基因组DNA中克隆得到伊氏锥虫微管结合蛋白p15(Te-MAP p15)基因.克隆片段长273 bp,编码90个氨基酸,预测分子量9.0kDa.经同源性比较,所得基因与Tb-MAP p15基因同源率达到94%.抗原性分析Te-MAP p15基因表达的氨基酸序列比T.brucei微管结合蛋白p15多5个,均参与组成其中1个抗原决定簇,并且此抗原决定簇序列形成在蛋白中常作为识别位点的α螺旋.将该基因亚克隆到pGEX-6P-1原核表达载体,转化大肠杆菌E.coli RS21宿主菌,经IPTG诱导,可成功表达.重组融合蛋白大小为35 kDa,与预期大小一致,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定为重组伊氏锥虫微管结合p15蛋白.
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抗伊氏锥虫VAT兔源"抗体库"的建立及其抗虫效果检测
将编号为01,02,03,04,05的5个伊氏锥虫克隆群体以107条/只的剂量经耳静脉分别接种至1只新西兰大白兔体内,免疫荧光试验检测抗体滴度达到高后,开始耳静脉采血提取抗血清.之后每隔2天提取一次抗血清,每只共提取10次,5只共50份血清等量(各占1/50)混合,称为抗活体锥虫血清"抗体库B";此外取BeTat 1.1,BeTat 1.2……BeTat 1.19,BeTat 1.20共计20个抗原变异体以107条/只的剂量经耳静脉分别接种至1只新西兰大白兔体内,免疫荧光试验检测抗体滴度达到高后,一次心脏采血,分离血清,20只共20份血清等量(各占1/20)混合,称为抗活体锥虫血清"抗体库A";取编号为01的伊氏锥虫克隆群体以100条/只的剂量腹腔注射分别接种小鼠和大鼠,镜检见虫后使用抗活体锥虫血清"抗体库B"和抗活体锥虫血清"抗体库A"分别进行治疗.结果显示"抗体库B"治疗组的小鼠保护率为93.75%,大鼠的保护率达到了100%,"抗体库A"的治疗效果则不明显.
关键词： 伊氏锥虫 抗原变异 抗原型 抗活体锥虫血清"抗体库" -
伊氏锥虫cDNA表达文库的构建
目的 构建伊氏锥虫cDNA表达文库.方法 利用DEAE-纤维素柱从小鼠血液中纯化伊氏锥虫,Trizol法提取总RNA,采用poly (A) Quik mRNA Isolation kit 分离纯化mRNA.运用cDNA Synthesis Kit 合成cDNA,以XR-λZAP为载体,构建伊氏锥虫cDNA表达文库.结果伊氏锥虫cDNA表达文库重组率为98%,滴度为0.9×106 pfu/ml,扩增后滴度为1×109 pfu/ml结论成功构建伊氏锥虫cDNA表达文库,为伊氏锥虫免疫相关因子的基因筛选奠定了基础.
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伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR鉴别检测方法的建立
目的 建立伊氏锥虫和路氏锥虫二重PCR鉴别检测方法.方法 根据路氏锥虫18S rRNA基因和伊氏锥虫RoTat 1.2 VSG基因特异序列设计两对引物,通过优化PCR反应体系与反应条件,建立种特异二重PCR鉴别检测方法.结果 用建立的二重PCR鉴别检测方法能特异扩增路氏锥虫和伊氏锥虫目的 片段,大小分别为261 bp和482bp;路氏锥虫和伊氏锥虫的低检出量分别均达1个虫体,检测日本血吸虫、杜氏利氏曼原虫与瑟氏泰勒虫等其他血液寄生虫均为阴性.结论 建立的二重PCR检测体系灵敏度高、特异性强,适用于路氏锥虫和伊氏锥虫的感染检测及流行病学调查.
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利用MGE-PCR技术研究锥虫亚属种间与亚种间的分子特性
目的分析锥虫亚属布氏锥虫、伊氏锥虫和马媾疫锥虫3个种以及布氏锥虫:指名亚种、冈比亚亚种、罗得西亚3个亚种间的遗传变异与进化关系.方法利用移动遗传因子(MGE)-PCR技术对26个锥虫虫株基因组进行扩增,同时利用邻位相连(NJ)法对扩增产物进行聚类分析.结果锥虫亚属的种间及亚种间的遗传差异明显,遗传距离在0到100%间均有分布(平均遗传距离为41.2%);布氏锥虫种内遗传变异度大,遗传相似系数只有41.15%,伊氏锥虫和布氏锥虫的同源性高,相似系数为62.94%;布氏锥虫指名亚种和罗得西亚亚种明显高于冈比亚亚种的遗传变异程度.结论锥虫亚属的种及亚种间的遗传变异程度较高;中国与南美洲的伊氏锥虫及中国与南美的马媾疫锥虫均应为同一起源.
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锥虫抗药性的遗传特性
锥虫病是由锥虫寄生于人和动物的血液而引起人和动物的一种疾病.锥虫抗药性的产生,可能给人和家畜带来较严重的后果[1],国外于1908年已注意到锥虫的抗药性问题[2、3],而我国于1988年第一次口头报道在云南用厂方推荐的安锥赛治疗剂量难以治愈家畜锥虫病,1991年沈杰等正式报道了我国伊氏锥虫云南株和安徽株对安锥赛已产生抗药性[4].迄今,报告产生抗药性的锥虫虫种有布氏锥虫(Trypanosoma brucei)等常见的8个种,其它未报告的锥虫并不意味着不产生抗药性.已报告产生抗药性的药物有苏拉明(Suramine)等30多种抗锥虫药物.抗药性是能遗传的,对锥虫抗药性的遗传特性的了解,能帮助我们正确地选择和使用药物、减少和避免抗药性的产生及怎样消除已有的抗药性具有极其重要的作用,其次也有助于锥虫的生理、生化及生物学研究.
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一种伊氏锥虫低温冷冻保种新方法研究
目的:探索一种简便易行的伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)低温冷冻保种新方法.方法:感染伊氏锥虫小鼠的肝和脾组织分别冻存于-20 ℃和-80 ℃低温冰箱7、10、60 d,观察复苏后伊氏锥虫的形态、活力及对小鼠的感染力.结果:伊氏锥虫在-20 ℃和-80 ℃温度下冻存7、10、60 d后,光镜下形态与新鲜组织内虫体一致.随着冻存时间延长虫体活力稍有下降.肝、脾组织-20 ℃或-80 ℃冻存60 d后虫体活力分别为74.47%,74.43%和74.62%,74.96%,差异无统计学意义(P>0.05).经-20 ℃和-80 ℃冷藏保存7、10 d后接种,小鼠虫血症出现时间均为5 d,保存60 d者为7 d.两种温度,不同时间保存虫体复苏后对小鼠感染成功率和致死率均为100%.结论:不加保护剂直接冷冻受染小鼠肝或脾组织保存伊氏锥虫,不失为一种经济、便捷的保种方法.
