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CDMP1转基因间充质干细胞片修复兔软骨缺损
目的 探讨软骨源性形态发生蛋白-1(CDMP-1)转基因细胞片修复兔软骨缺损的能力.方法 腺病毒转染CDMP1基因至第4代兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)中,连续培养7～14 d后接种至温度敏感性培养皿中制备细胞片,real time PCR和Western blot法检测转基因细胞片的CDMP1及Ⅱ型胶原蛋白表达;用细胞片工程技术构建组织工程化细胞片并移植入兔甲状软骨缺损处修复软骨缺损.实验分:1)BMSCs细胞片组;2)转染As-CMV-eGFP细胞片组;3)转染As-CMV-hCDMP1-IRES-eGFP细胞片组.分别于术后4和8周检测工程化软骨的Ⅱ型胶原蛋白及蛋白多糖(GAG)表达.结果 检测到转基因细胞片中CDMP1的表达;所获得的工程化软骨免疫组化和阿利新蓝染色显示:A组Ⅱ型胶原蛋白和GAG表达阳性,B组和C组Ⅱ型胶原蛋白和GAG表达阴性(P＜0.05).结论 CDMP转基因细胞片具有较好的软骨分化活性,可有效地修复兔喉软骨缺损.
关键词： 细胞片 软骨源性形态发生蛋白-1 骨髓间充质干细胞片 腺病毒转染 软骨组织工程 -
正交法探索平板离心构建无载体细胞片的可行性
背景:实体器官移植目前在实验室及临床已积极展开,具有良好的治疗效果,但实体组织器官供体来源的匮乏是世界性的难题之一.目的:用平板离心技术构建细胞片以探索一种新的实体组织构建方法.方法:首先用梯度离心力对人皮肤成纤维细胞进行离心力反应和细胞即时贴壁率的探索,设计出不同离心力水平、细胞浓度及离心时间,用正交实验优选佳离心参数,用优选所得的佳离心条件进行稳定重复实验.用佳离心条件进行单层细胞离心实验,自然培养组为对照组,观察离心后单层细胞的活性及增殖活力.用离心法进行多层细胞片的构建,然后进行体外培养及苏木精-伊红染色切片以观察不同层数细胞片的形成情况.结果与结论:佳构建参数为细胞浓度9×105 cm-2,离心转速2 200 r/min,离心时间4 min,细胞种植效率可达(93.75±9.58)%;单层对照显示离心贴壁细胞增殖活性良好;苏木精-伊红染色观察显示可快速形成活性良好的细胞片.提示离心速构法形成了无支架组织,可作为一种方便、快捷、高效的实体组织工程构建方法.
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兔气管黏膜上皮细胞片的制备
目的 探讨兔气管黏膜上皮细胞片的体外制备方法.方法 使用组织块法体外分离培养兔气管黏膜上皮细胞,进行鉴定后,将其种植于UpCell培养皿,待细胞长满皿底后,将环境温度降至20℃,利用培养皿温敏特性制备出上皮细胞片.结果 利用组织块法分离培养的兔气管黏膜上皮细胞,角蛋白CK-18表达阳性,经过UpCell培养皿的培养,当降低温度至20℃时,可分离出完整的上皮细胞片,经鉴定细胞片内的细胞连接紧密,并相互叠加.结论 利用UpCell培养皿的温敏反应性可成功的制备出完整上皮细胞片,上皮细胞片为组织工程气管的构建提供了新的策略.
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软骨源性形态发生蛋白1转基因细胞片的初步探讨
目的 探讨软骨源性形态发生蛋白1 (cartilage-derived morphogenetic protein 1,CDMP1)转基因细胞片的构建及其活性鉴定. 方法 取1月龄新西兰白兔骨髓分离培养BMSCs,取第3～6代细胞进行实验.实验分为3组,A组:腺病毒(adenovirus,Ad)-巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)-人CDMP1 (human CDMP1,hCDMP1)-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染BMSCs,B组:Ad-CMV-EGFP(空载体腺病毒)转染BMSCs,C组:未转染的BMSCs.倒置荧光显微镜观察3组细胞荧光表达情况,MTT法检测3组细胞增殖活力.将3组处于对数生长期的细胞接种于温度敏感性6孔板获得细胞片,行形态学及HE染色观察,RT-PCR及Western blot检测3组细胞片hCDMP1和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白表达,阿利新蓝染色检测糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)表达. 结果 倒置荧光显微镜下观察示转染细胞在72 h表达明亮荧光,转染效率达90％; MTT法检测示,3组细胞生长曲线基本呈S形,培养1～9 d吸光度(A)值比较差异均无统计学意义(P＞0.05).通过温度敏感性6孔板体外可成功收获完整的三维立体细胞片结构,RT-PCR及Western blot检测示,A组细胞片中hCDMP1和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白均呈阳性表达,B、C组均为阴性.HE染色和阿利新蓝染色示,A组纤维组织丰富,细胞外基质较多,蓝色异染颗粒多;B、C组细胞外基质相对较少,无明显特异性蓝染颗粒;A组GAG阳性染色面积明显低于B、C 组,灰度值明显高于B、C组(P＜0.05). 结论 hCDMP1基因转染的BMSCs细胞片能表达Ⅱ型胶原和GAG,具有成软骨活性,其克服了传统组织工程中细胞利用率低、支架异质性等缺点,有望构建出致密的组织工程软骨,为软骨组织工程进一步发展提供了新思路.
关键词： 软骨组织工程 细胞片 软骨源性形态发生蛋白1 BMSCs 腺病毒基因转染 -
组织工程细胞片构建方法
目的 综述组织工程细胞片构建方法的研究进展并展望前景.方法 广泛查阅近年来有关构建组织工程细胞片的研究与应用的文献,选择常见方法分别进行阐述.结果 通过组织工程细胞片方法构建的组织,可以打破传统组织工程方法对组织工程发展的限制.目前构建组织工程细胞片的方法主要包括温敏培养皿、胶原凝胶、磁力组织工程、表面粗糙的颗粒单分子层及聚合电解质.结论 组织工程细胞片构建方法可行,具有广泛的应用前景.
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组织工程细胞片在牙周组织再生中的作用
牙周组织工程系指将在体外以理想的种子细胞和细胞外基质构建的具有生命活性的复合体植入牙周缺损部位,对牙周缺损部位进行结构功能性重建.组织工程细胞膜片构建主要有温敏培养皿、刮取法、胶原凝胶法、磁力组织工程法、表面粗糙颗粒单分子层法和聚合电解质等.牙周组织工程细胞片主要有牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞片,分别将其与不同的载体叠加并植入动物体内,可发现细胞外基质和纤维黏附,牙骨质样组织和牙周组织再生.将人牙周膜成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞、人真皮成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞共培养,所形成的细胞片可生成类似原生血管的管状结构.目前的组织工程细胞片的生物力学性能较差,与传统支架结合仍然存在着材料降解引起的组织纤维化和免疫排斥等问题,组织工程细胞片在牙周组织工程应用中具有较大应用前景;但是,要实现牙周组织的完全再生,其技术有待进一步的研究.本文就细胞片的构建、不同的牙周组织工程细胞片、细胞片工程面临的问题等研究进展作一综述.
